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       【摘要】 
       目的观察大黄虫对药不同剂量含药血清对原代培养人子宫肌瘤细胞增殖的影响。方法原代培养并建立人子宫平滑肌瘤细胞系，采用中药血清药理学方法处理细胞，以MTT比色法检测含药血清作用于子宫肌瘤细胞12，24，48，72 h的光密度值，计算细胞存活率。结果大黄虫对药含药血清可直接抑制子宫肌瘤细胞增殖。结论大黄虫对药含药血清可直接抑制子宫肌瘤细胞增殖，子宫肌瘤细胞是大黄虫对药含药血清发挥治疗作用的靶细胞。
       【关键词】  大黄; 虫; 子宫肌瘤; 细胞培养; 含药血清
       Abstract：ObjectiveTo observe the effects of different dosages of medicated sera of Dahuang and Zhechong on the proliferation of human leiomyoma cells in vitro.MethodsHuman leiomyoma cells were cultured in vitro.Treated the cells with Chinese herbs serum pharmacology method.The MTT assay was adopted to investigate the survival rate of 12 h,24 h,48 h,72 h after the cells were treated.ResultsSerum containing Dahuang and Zhechong showed an direct inhibitory action on proliferation of uterine leiomyoma cells.ConclusionDahuang and Zhechong medicated serum has inhibitory effect on proliferation of hysteromyoma cells,which indicates hysteromyoma cells are target cells.
       Key words：Dahuang,Zhechong; Leiomyoma; Cell culture; Medicated serum
       子宫肌瘤(myoma of uterus)又称子宫平滑肌瘤(leiomyoma of uterus)，是女性生殖器官中最常见的良性肿瘤，也是人体最常见的肿瘤之一，它好发于生育年龄的妇女，素有“妇科第一瘤”之称。根据其临床表现，属中医“癥瘕”范畴，即妇女下腹包块，伴有或痛或胀或满或阴道出血溢液等症状的病证。由于淤血内阻在疾病中的关键作用，活血化淤方药得到普遍推崇，应用和研究最多并最早确认疗效的是桂枝茯苓丸。随着研究的不断深入，我们发现，在改善血淤证患者体内血液黏、凝、浓、聚状态、消散肌瘤方面，破血消癥类中药制剂的效果明显优于活血化淤类中药制剂。大黄、虫对药组合出自经方下淤血汤、大黄虫丸等，具有活血化淤，消散癥积之功用。两药相须为用，大黄入血偏于泻，虫入血偏于通，使脉络畅通，淤血得散[1]。本实验采用细胞生物学与中药血清药理学相结合的方法，研究大黄、虫含药血清对原代培养的人子宫肌瘤细胞的生长抑制作用，探讨经方对药的作用机制。
       1 材料
       1.1 动物及含药血清的制备清洁级健康雌性SD大鼠20只，鼠龄80～100 d，体质量180～220 g。购自第四军医大学实验动物中心，用于制备含药血清。分5组，每组4只，空白组(无药血清组)，桂枝茯苓胶囊组(含有桂枝茯苓胶囊的含药血清组)，大黄虫对药小剂量组，大黄虫对药中剂量组，大黄虫对药大剂量组。灌胃给药，2次/d，共3 d，末次给药前8h禁食不禁水。桂枝茯苓胶囊以临床日用量的10倍给药。大黄虫对药小、中、大剂量组以临床日用量的1，2，4倍给药。末次给药后1h股动脉采血，分离血清，经56℃恒温水浴30 min处理灭活补体后，用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌分装，置-20℃冻存备用。
       1.2 药物及试剂 大黄虫对药，购自陕西中医学院金秋门诊，经本院药剂科鉴定无伪劣品。药物加水浸泡常规煎煮过滤，水浴蒸发至大、中、小剂量，每毫升含生药量分别为0.506 g，0.253 g，0.126 g，置于4℃冰箱保存备用。桂枝茯苓胶囊，连云港康缘制药有限责任公司，0.31g/粒。国药准字号210950005，产品批号060518。胰蛋白酶、DMEM培养基、新生胎牛血清、抗α-平滑肌肌动蛋白(α-Actin)、MTT、SP免疫组化试剂盒均购自第四军医大学宝泰克生物试剂有限公司。青霉素、链霉素、碳酸氢钠、二甲基亚砜(DMSO)、氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、苯甲酸雌二醇、黄体酮均为第四军医大学实验动物中心309细胞培养室友情提供。
       1.3 仪器电动玻璃匀浆机(宁波新芝科器研究所，DY-1)，电子天平(上海精科天平，Ja12002)，低温高速离心机(Heraeus instruments，Biofuge fresco)，低温高速台式离心机(Heraeus instruments，Biofuge stratos)，超净工作台(汇龙仪表电子责任有限公司，SHJ系列)，电热恒温水槽(精宏实验设备有限公司，DK-600型)，可调式封闭电炉(上海浦东荣丰科学仪器有限公司)，台式离心机(Heraeus instruments，BIOFUGE PICO)，移液枪(GILSON，200 μl、10 μl、1 000 μl)，NAPCO-5410型CO2培养箱、OLYMPUS倒置显微镜、MR5000型酶标仪。一次性过滤器、培养瓶、离心管、吸管、加样枪头、微量振荡器均由第四军医大学实验动物中心细胞培养室309实验室友情提供。
       2 方法
       2.1 子宫肌瘤细胞的培养和鉴定 子宫肌瘤标本共60例，40例由陕西省肿瘤医院妇瘤科手术提供，20例由西安市第四人民医院病理科提供。取自因子宫肌瘤而行子宫全切或肌瘤剔除术的绝经前妇女，年龄36～48岁，平均40岁。肌瘤部位为浆膜下或肌壁间，未曾接受性激素治疗。术前取得患者及家属同意，标本均经病理证实。子宫离体后立即无菌切取肌瘤组织约2.0 cm×2.0 cm大小，用0.01%PBS冲洗后，分别置于盛有10%DMEM+双抗消毒液的消毒瓶中，1h内送进实验室。组织贴块法[2]原代培养，约3～4周出现致密的细胞层时取出组织块，使细胞生长融合，再用胰酶消化法[2]传代培养。7～10 d后细胞生长成致密层时可再传代，传代细胞均为梭形细胞。选生长良好、形态均一的第3～5代细胞，α-平滑肌肌动蛋白(α-Actin)SP免疫组化法鉴定后用于实验。
       2.2 细胞铺板培养及实验分组 将第3～5代子宫肌瘤细胞消化，加20%完全DMEM培养液，调整细胞浓度为3×105/L接种于96孔培养板中，100 μl/孔，每组设8个平行孔，共6组：空白对照组(无血清DMEM培养液)、细胞对照组(无药血清组，20%正常血清)、阳性对照组(20%桂枝茯苓胶囊含药血清)，大黄虫对药大、中、小剂量组(20%大黄虫对药大、中、小剂量含药血清)。孵育24 h细胞贴壁后，吸弃上清，加入无血清低糖型DMEM培养液孵育24 h，让细胞同步生长于G0期，然后吸弃培养基，更换为含有不同药物的待测样品的培养基。
       2.3 MTT检测[4]将上述同步生长于G0期的子宫肌瘤细胞培养基吸弃，每孔加入100 μl不同组别的含药血清，置正常培养条件下培养，每48小时换液。12，24，48，72 h后，每孔加入5 mg/ml的MTT溶液20 μl，继续培养4 h，吸弃孔内培养基，每孔加入100 μl DMSO(二甲基亚砜)，振荡摇匀15 min，室温静置20 min后，在酶联免疫检测仪(MR5000型酶标仪)上(选择570 nm波长)测定各孔吸光度(OD)值，并计算细胞存活率，即：细胞存活率(%)=实验组吸光度值/对照组吸光度值×100%。重复上述实验3次，取其均值。
       2.4 数据处理采用SPSS10.0统计软件包处理，数据用±s表示, 组间差异比较用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。
       3 结果
       3.1 子宫肌瘤细胞的原代培养结果见图1～6。图1 子宫肌瘤原代细 图2 子宫肌瘤原代细胞胞第15天(单个 第22天(肌瘤细胞的肌瘤细胞) 开始融合生长)图3 子宫肌瘤原代细胞 图4 第2代子宫肌瘤细胞第29天(肌瘤细胞铺 (生长第7天)满培养瓶生长面)图5 第2代子宫肌瘤细胞 图6 用免疫组化法鉴定子宫(第14天，漩涡状) 肌瘤细胞(99%以上细胞抗α-actin抗体阳性)
       3.2 大黄虫对药含药血清对原代培养人子宫肌瘤细胞的影响MTT法检测各孔吸光度值，显示用药后各组吸光度值均较对照组明显下降(P<0.05)，细胞存活率随大黄虫对药剂量的升高而降低。见表1。表1 大黄虫对药含药血清对子宫肌瘤细胞的影响从表1可见，肌瘤细胞自身对比，无药血清组与空白组比较，无药血清组在24 h，48 h，72 h观察点的光密度OD值高于空白组，有显著性差异(P<0.05)，说明无药血清可以刺激子宫肌瘤细胞增殖。各用药组与无药血清组比较：大黄虫对药高剂量组在各个时间观察点的光密度OD值均明显低于无药血清组(P<0.01)，大黄虫对药中剂量组在24h，48h，72h的OD值低于无药血清组(P<0.05)，说明大黄虫对药高、中剂量组均有直接抑制子宫肌瘤增殖的作用，初步显示呈量效关系，但随着作用时间的延长大黄虫高剂量组的抑增效应有下降趋势。桂枝茯苓胶囊组在24，48，72 h的OD值低于无药血清组，有显著性差异(P<0.01)。大黄虫大、中、小剂量组与桂枝茯苓胶囊组比较无显著性差异(P>0.05)。
       4 讨论
       本实验采用细胞生物学与中药血清药理学相结合的方法，在成功培养出人子宫肌瘤细胞的基础上，采用MTT法检测含药血清对子宫肌瘤细胞存活率的影响。结果显示，破血消癥对药组合大黄虫含药血清对子宫肌瘤细胞增殖有抑制效应。MTT是一种检测细胞增殖活力的方法，原理是哺乳类动物活细胞线粒体内膜中的呼吸链上与呼吸链有关的琉拍酸脱氢酶，可将外源性淡黄色的MTT还原成难溶性的蓝紫色的甲瓚结晶，沉淀在细胞中，而死细胞无此功能，形成的结晶与增生的细胞数成正比，加二甲基亚砜(DMSO)溶解此蓝紫色结晶，通过酶联免疫检测仪测定其光吸收值，即可推算出活细胞的数量。中药含药血清药理学方法是指将中药或复方经口给动物灌服一定时间后采集动物血液，分离血清，用此含药物成分的血清进行体外实验的一种方法。该法体现了体内与体外实验的结合，其实验结果与体内实验结果有较好的一致性，己成为中药体外药理实验的常用新方法。以本实验为基础，还将进行含药血清对细胞因子促肌瘤有丝分裂的拮抗研究，进一步揭示经方对药的作用效果和机制。
       【参考文献】
         　[1] 王 付.经方对药[M].北京：学苑出版社，2005：111.
       
       [2] 司徒镇强，吴军正.细胞培养[M].西安：世界图书出版西安公司，2007：57.
       
       [3] 喷昆龙.测定细胞存活和增殖的MTT方法的建立[J].免疫学杂志，1992，8(4)：266.