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       【摘要】 
       目的研究复方双苓止泻散对小肠在mRNA水平表达增殖性细胞核抗原(PCNA)的影响。方法取60只SD大鼠， 制作腹泻模型，将其分为以下6组：腹泻模型组(DM)，正常对照组(NC)，低剂量复方双苓止泻散组(L)，中剂量复方双苓止泻散组(I)，高剂量复方双苓止泻散组(H)，阳性对照药物(万鑫母仔快康)组(PC)。用药48 h后，大鼠腹泻停止，取距Treitz韧带5～10 cm处的近端小肠组织2 cm，行RT-PCR法检测PCNA在mRNA水平表达的情况。结果半定量分析表明：DM组PCNA在mRNA水平的表达明显弱于其余5组(P<0.01); I组、H组、PC组与NC组之间PCNA mRNA的表达无显著性差异(P>0.05)，但均高于DM组及L组的表达PCNA mRNA。结论复方双苓止泻散止泻同时，增强了腹泻大鼠小肠黏膜PCNA mRNA的表达。
       【关键词】  增殖细胞核抗原; 腹泻模型; 小肠黏膜; 反转录PCR
       肠黏膜上皮是肠屏障中最重要的部分，它具有吸收及屏障功能[1]。上皮组织的完整性及再生能力对于保持肠黏膜的吸收具有重要意义。一般情况下，小肠黏膜上皮更新率为2～5 d。小肠黏膜上皮更新是不断地由肠隐窝区干细胞前上迁移、增殖、分化，以及时更新黏膜上皮，维持上皮组织的完整性。在制作大鼠腹泻模型的基础上，观察本课题组提供的复方双苓止泻散在止泻的同时对小肠黏膜上皮的修复作用。增殖性细胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen，PCNA)是真核细胞DNA合成所必需的一种36KD酸性核蛋白，DNA聚合酶的辅助蛋白，与细胞增殖、DNA合成有关[2]。复方双苓止泻散是纯中药制剂，具有抗炎、抑菌、治腹痛及免疫调节等功效。本实验是以PCNA在mRNA水平的表达作为观察指标来评估小肠黏膜细胞的增殖状态，评价复方双苓止泻散在止泻的同时对小肠上皮增殖的影响。
       1 材料与方法
       1.1 动物分组及模型制作健康Sprague-Dawley大鼠60只，出生80～100 d，雌雄不限，体质量180～220 g，由河北医科大学动物实验中心提供。将60只大鼠随机分为6组，每组10只，分别为：正常对照组(NC)，腹泻模型组(DM)，低剂量复方双苓止泻散组(L)，中剂量复方双苓止泻散组(I)，高剂量复方双苓止泻散组(H)，阳性对照药物(万鑫母仔快康)组(PC)。参照中国药科大学中药研究所周干南法[3]，规范操作制备腹泻模型并确定造模成功。造模1周后，低剂量复方双苓止泻散组：制作腹泻模型成功后，灌胃(ig)给予复方双苓止泻散[0.31 g(kg·d)]，1次/d。中剂量复方双苓止泻散组：制作腹泻模型成功后，灌胃(ig)给予复方双苓止泻散[0.62 g(kg·d)]，1次/d。高剂量复方双苓止泻散组：制作腹泻模型成功后，灌胃(ig)给予复方双苓止泻散[1.24 g(kg·d)]，1次/d。阳性对照药物(万鑫母仔快康)组：制作腹泻模型成功后，灌胃(ig)给予万鑫母仔快康[0.62g(kg·d)]，1次/d。正常对照组(NC)：不予番泻叶煎剂造模型，仅灌胃(ig)给予生理盐水[5ml(kg·d)]，1次/d。
       1.2 手术处理和组织标本的取材待大鼠粪便转为干便时(给药2 d后)即取材。对手术器械、手术操作台及大鼠进行消毒，用10%水合氯醛麻醉(0.4 ml/g)对实验大鼠进行麻醉，沿腹正中线剪开腹壁暴露腹腔，迅速切取距离Treitz韧带5～10 cm处的近端小肠组织2 cm，剥离肠系膜，剖开肠管，快速用冷生理盐水冲洗肠腔3～5次， 即放入DEPC 处理过的冻存管内置于液氮中备用，以做RT-PCR。
       1.3 RT-PCR反应
       1.3.1 引物的设计与合成从Genebank中检索到大鼠PCNA、β-actin基因cDNA序列，应用Primer5.0 软件设计引物：PCNA(323 bp):上游：5"-AGGGCTGAAGATAATGCTGATA-3"下游：5"-CTCATTCATCTCTATGGTCACAG-3" β-actin(619 bp):上游：5"-AAGAGAGGCATCCTCACCCT-3"下游：5"-GGAAGGAAGGCTGGAAG-3" 以上引物由北京赛百盛基因生物公司合成。
       1.3.2 组织总RNA的提取采用Trizol 法，提取组织总RNA，按说明书进行操作。具体步骤如下：在液氮中将小肠组织50～100 mg研磨成粉末，趁液氮尚未挥发光时，将粉末转移至1.5 ml离心管中，加入1 ml Trizol液，悬浮组织，充分击打，使细胞完全裂解(15～30℃放置5 min)。用5 ml针筒抽吸匀浆液15～20次，以剪切基因组DNA。加入0.2 ml氯仿，颠倒混匀15～30 s。离心12 000×g，2～8℃下5 min。将上清液小心转移到Nase-free 1.5ml 离心管中，加入等体积异丙醇，室温放置5 min。离心12 000×g，2～8℃下5 min。小心弃去上清液，防止RNA沉淀丢失。75%酒精洗涤2次：700μl/次， 离心12 000 g，2～8℃下2 min。尽可能彻底吸走上清(防止RNA沉淀丢失)，沉淀经真空干燥后，溶于30～50 μl RNase-free water中。
       1.3.3 RNA 完整性的鉴定取总RNA提取液3μl，加上样缓冲液1 μl混合，1%琼脂糖凝胶电泳(含溴化乙锭)电泳，电泳缓冲液1×TBE，电泳条件125 V、80 mA、30 min，在紫外透射仪上观察，显示出清晰的18 S和28 S两条rRNA带，说明提取的RNA完整，备用。
       1.3.4 RNA定量取总RNA提取液1μl，用三蒸水稀释1 000倍，用751紫外分光光度计测A260及A280比值，A260/A280 在1.8以上者可用，表示RNA较纯，没有DNA或蛋白质污染。
       1.3.5 逆转录反应在冰浴的0.5 ml 0.1%DEPC 处理过的Eppendorf 管中加入逆转录反应体系(20 μl)，如下：RNA模板8 μl，β-actin引物1μl，混匀后，95℃ 3 min，冰浴30 s，再加入：5×Reaction Buffer 4 μl、 RNase Inhibitor(40 u/μl) 1 μl、dNTPs(10 mmol/L) 5μl，轻轻混匀，离心3～5s。再加入：M-MLV RTranseriptase(200 u/μl)1μl 37℃水浴45 min， 95℃，5 min，4℃下备用。
       1.3.6 PCR反应反应体系含cDNA5μl，PCNA上游引物1 μl，PCNA下游引物 1 μl，10×Taq buffer 2 μl，PCR染料2 μl，dNTPs10 m M 0.5 μl，Taq 酶0.3 μl，RNase-free water 8.2μl。 PCR热循环参数：94℃ 预变性5 min，然后按下列参数进行PCR扩增：94℃变性30 s;55℃复性30 s;72℃延伸40 s;进行30次循环后，进一步72℃下再延时7 min。
       1.4 RT-PCR 半定量分析取10 μl PCR反应产物经1%琼脂糖凝胶(含溴化乙锭)电泳85 mA、125 V 、40 min，Goldview 染色，紫外透射仪上观察结果，扫描至计算机中，通过复日FR-980生物电泳图像分析系统分别测得PCNA 、β-actin条带的灰度值，二者比值作为各自的PCNA mRNA 相对表达水平。
       1.5 统计学分析计量资料结果以 ±s表示，所有数据用SPSS13.0统计软件处理，进行t检验、单因素方差分析及相关分析;检验水准a =0. 05，以P<0. 05时认为差异显著，具有统计学意义。
       2 结果
       电泳图像显示各组PCNA mRNA条带清晰，PCNA在各组小肠组织中均有表达(图1)，PCNAmRNA条带位于200～500bp之间，位置与目的基因323bp大致相符;对其半定量分析表明，DM组PCNA在mRNA水平的表达明显弱于其余5组(P<0.01); I组、H组、PC组与NC组之间PCNA mRNA的表达无显著性差异(P>0.05)，但均高于DM组及L组的表达PCNA mRNA(表1)。
       3 讨论
       PCNA是一种分子量为 36 KD 的核蛋白，在 DNA 复制和核苷酸切除修复过程中发挥重要作用的蛋白质[4]。贯穿分布于细胞周期，在G1晚期至S期达到高峰，只有当细胞处于活跃的增殖状态时才可检测到，是评价肿瘤细胞增殖活性的常用指标之一[5]。PCNA 是 DNA 复制和细胞分裂过程中 DNA 多聚酶δ最重要的辅助因子，它通过与细胞周期蛋白及细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶(cyclin-dependent kinase，CDK)结合，而发挥促进细胞增殖的作用。PCNA 含量的变化与 DNA 的合成速度相一致，其表达水平与细胞增殖密切相关。检测 PCNA 是评价细胞增殖状态的可靠指标[6]。故PCNA可以简单反应肠黏膜细胞增殖的状态。自左至右依次为：L，I，H，PC，DM，NC ，maker图1 各组PCNA mRNA表达电泳图表1 各组大鼠小肠黏膜PCNA mRNA表达相对含量的比较复方双苓止泻散有效改善了腹泻症状。复方双苓止泻散的配方主要成分为茯苓、猪苓、黄芪、葛根、大枣、高良姜、当归等，配方中的多种成分有抗炎、抑菌作用，还可调节胃肠功能，保护胃肠上皮[7，8]。本研究显示低、中、高复方双苓止泻散同阳性对照组一样可以增强PCNA mRNA的表达，提示复方双苓止泻散增强了肠黏膜细胞增殖状态，这些增殖的细胞会不断向上迁移，补充或替换坏死的上皮细胞。说明复方双苓止泻散对腹泻后损伤的肠黏膜有修复作用。此外，I组、H组、PC组与NC组之间PCNA的表达无显著性差异(P>0.05)，但均高于DM组及L组的阳性表达，提示中、高剂量复方双苓止泻散在促进肠黏膜细胞增殖、肠黏膜结构的恢复效果明显优于低剂量复方双苓止泻散的治疗效果。
       【参考文献】
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