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       【摘要】 
       目的研究玉米苞叶对高血脂大鼠血管内皮及平滑肌细胞凋亡与突变型p53表达的药用效应。方法选用雄性SD大鼠,随机分为正常对照、病理模型、阳性对照及玉米苞叶煎剂组，复制食饵性高脂血症,玉米苞叶煎剂预防性给药,以吉非罗齐为阳性药对照。流式细胞术检测内皮和平滑肌细胞凋亡率及突变型p53表达量。结果玉米苞叶煎剂组内皮细胞突变型p53表达下降(P﹥0.05)，凋亡率下降(P<0.05)，增殖指数轻度上升(P﹥0.05);平滑肌突变型p53表达下降(P<0.05)，凋亡率上升(P<0.05)，增殖指数下降(P<0.05)。结论玉米苞叶煎剂具有调控大鼠血管内皮及平滑肌细胞p53表达，平衡两种细胞凋亡与增殖相关性的药用效应。
       【关键词】  玉米苞叶; 内皮; 平滑肌; 突变型p53
       玉米苞叶煎剂具有抗动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)的药用效应已被我们多次实验结果证实[1～3]。本文就高血脂大鼠主动脉内皮细胞(endothelial cells，EC)及平滑肌细胞(smooth muscle cell,SMC)凋亡率及增殖指数与突变型p53表达的相关性，进一步揭示玉米苞叶干预AS早期损伤的作用。
       1 材料与仪器
       1.1 药物收集成熟洁净的玉米苞叶,晒干切碎，每克玉米苞叶加蒸馏水100 ml煮沸3 h, 浓缩至1.5 g/ml生药备用。选用羧甲基纤维素钠(CMC)为溶剂配制吉非罗齐(Gemfibrozil 由保定古城制药厂提供，批号：040625)CMC溶液，浓度：0.016 g/ml。
       1.2 动物健康成年雄性SD大鼠，体质量180～200 g[由华中科技大学同济医学院实验动物学部提供 ，医学动物合格证号：SCXK(e)2004-0007，清洁级]，32只。
       1.3 试剂与仪器突变型p53兔抗人多克隆抗体，由美国Santa Cruz公司提供。流式细胞仪，Epics-XLⅡ型，美国Beckman Coulter 公司生产。
       2 方法
       2.1 动物分组与模型复制动物适应性喂养1周后,随机分为正常对照、病理模型、阳性药对照、玉米苞叶煎剂组,每组8只。正常组给予基础饲料喂养，其余3组给予高脂饲料(87.48%基础饲料+10%猪油+2%胆固醇+0.5%胆盐+0.02%他巴唑),各组动物自由饮水。
       2.2 给药方法造模同时，阳性对照组用10 ml/(kg·d)(合0.16 g /kg·d)吉非罗齐溶液灌胃，玉米苞叶煎剂组每日以玉米苞叶水煎剂10 ml/(kg·d)(合生药15g/kg·d)灌胃。正常组，模型组分别给予等量自来水灌胃，随体质量增长调节药量，实验9周。
       2.3 流式样品制备与检测每组各取6只大鼠，断头处死，打开胸腹腔，暴露主动脉，剥离血管周围结缔组织，于胸主动脉同一部位取材，2 cm长，撕除外膜，分别剥取内皮及中膜层，70%乙醇固定，制备单细胞悬液，碘化丙啶染色，流式细胞仪检测EC及SMC凋亡率，用Muticycle AV分析软件对DNA细胞周期拟合分析。计算出DNA组方图各时相分布的百分比，以增殖指数(proliferation index, PI)表示细胞的增殖活性。先后加入突变型 P53兔抗人多克隆一抗，IgG-PE二抗。应用Expo 32 ADC进行免疫荧光数据分析，以荧光指数(FI)表示蛋白表达的相对含量。
       2.4 统计学处理 全部数据用±s表示,采用SPSS(13.0)分析软件，单因素方差分析进行数据处理。
       3 结果
       3.1 玉米苞叶对EC突变型p53表达、凋亡率及增殖指数的影响玉米苞叶煎剂组EC的突变型p53表达较模型组下降(P﹥0.05);凋亡率较模型组明显下降(P<0.05);增殖指数轻度上升(P﹥0.05)。见表1 。
       3.2 玉米苞叶对SMC突变型p53表达、凋亡率及增殖指数的影响玉米苞叶煎剂组SMC突变型p53表达较模型组显著下降(P<0.05) ;凋亡率明显高于模型组(P<0.05) ;增殖指数低于模型组(P<0.05)。见表2。表1 玉米苞叶对EC p53表达、凋亡率及增殖指数的影响表2 玉米苞叶对SMC p53表达、凋亡率及增殖指数的影响
       4 讨论
       在AS早期,高脂氧化损伤后的血管内膜炎症反应致内皮损伤, 诱发平滑肌细胞凋亡与增殖失衡,是多种促凋亡与抑凋亡基因的调控作用紊乱的复杂结果。研究发现,突变型p53在AS病变组织中的异常表达较高[4], 本实验模型组的主动脉内膜损伤处在AS早期阶段,VEC的突变型p53表达明显上升，其促凋亡作用增加,致 VEC凋亡较正常对照组增加近8倍,其增殖指数仅相当于正常对照组的1/2,是AS早期内皮损伤严重,修复障碍的特征。模型组SMC突变型p53较对照组上升1倍,凋亡率亦相应增高,但SMC的增殖指数不但没有下降,反而较正常组增加了8倍,该指标的变化与内皮相比截然相反,认为正是内皮损伤诱导AS初期SMC呈现增殖异常活跃,增殖与凋亡严重失衡的结果。
       玉米苞叶作用后, VEC 的p53基因突变减少，凋亡率降低，增殖指数较模型组显著增加,提示玉米苞叶的药用效应在于通过调控相关基因p53表达,减少内皮死亡,促进分裂增殖及内膜修复。而玉米苞叶对SMC的p53表达,凋亡及增殖的影响显示出与VEC结果不同。玉米苞叶组SMC的p53表达较模型组降低，凋亡率上升，而增殖指数大幅度下降,这与突变型p53有促进异常细胞增殖，抑制其凋亡的作用[5]的观点相吻合, 可能是玉米叶的药理活性通过其他环节调控突变型p53基因表达，促进了SMC凋亡;同时玉米苞叶对EC的保护作用减轻了对SMC的刺激，其凋亡加快，增殖减慢， 使AS早期SMC的增殖与凋亡趋于新的平衡, 显现出EC与SMC增殖的相关性。
       玉米苞叶不是传统的中药材, 但在我们以往系列的实验研究中证实，玉米苞叶水煎剂预防性给药,可使食饵性高脂血症家兔主动脉内膜粥样硬化一期病变的脂斑面积显著缩小[6],治疗性给药后,对家兔主动脉病变具有同样的拮抗AS作用,对尚未出现AS形态改变的高血脂鹌鹑和大鼠动脉内膜损伤仍显示出良好的干预作用[7], 增加内皮NO的分泌，减少ET释放[8]，影响IL-1和IL-8的分泌(另文待发表),扫描和透射电镜观察内皮和平滑肌的超微结构变化,从形态角度支持了玉米苞叶确有改善血管内皮损伤的药用效应。上述实验结果证实, 玉米苞叶具有多层面的抗AS作用的药理活性。
       【参考文献】
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       [4] 刘 凛.肿瘤中p53、iNOS表达及二者相关性研究[J].医学研究杂志, 2006, 35(7):71.
       
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       [8] 甄艳军,侯建明,姜秀娟, 等.玉米苞叶煎剂对高脂大鼠血清NO、ET水平及内皮凋亡的作用[J].辽宁中医杂志，2009， 36(2)：307.