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       【摘要】 
       目的观察复元胶囊对大鼠膝骨关节炎模型软骨细胞凋亡相关基因Bax和Bcl-2的影响，探讨其治疗骨关节炎的作用机制。方法48只雄性SD大鼠随机分成正常组、模型组、壮骨关节丸组、复元胶囊组，每组12只。除正常组外，其余各组采用Hulth法建立膝骨关节炎动物模型。4周后，壮骨关节丸组、复元胶囊组分别给予壮骨关节丸、复元胶囊灌胃，而正常组、模型组给予生理盐水。8周后，取大鼠膝关节软骨作透射电镜观察细胞超微结构，原位末端标记法(TUNEL法)检测软骨细胞凋亡，逆转录/聚合酶链反应(RT-PCR)法检测Bax和Bcl-2mRNA的表达。结果复元胶囊能抑制骨关节炎软骨细胞过度凋亡，降低促凋亡基因Bax mRNA表达，增加凋亡抑制基因Bcl-2mRNA的表达，并调节Bax/Bcl-2的比例。结论复元胶囊通过降低促凋亡基因Bax mRNA表达、增加凋亡抑制基因Bcl-2mRNA的表达、调节Bax/Bcl-2的比例而抑制骨关节炎软骨细胞的凋亡。
       【关键词】  膝骨关节炎; 细胞凋亡; 复元胶囊 ; Bax; Bcl-2
       骨关节炎(Osteoarthritis，OA)是临床常见的、严重影响中老年人生活质量的一种慢性、进行性关节疾病，关节软骨退行性改变是OA发病的中心环节。近年来研究报道，软骨细胞凋亡在关节软骨退行性改变过程中起着重要作用[1，2]。复元胶囊是临床上长期用于治疗骨关节炎有明显疗效的中药复方实验制剂，但是其分子水平的作用机理尚不十分清楚。本实验采用Hulth法制造大鼠膝关节实验性骨关节炎动物模型，以临床上常用于治疗骨关节炎的中成药壮骨关节丸作对照，观察复元胶囊对大鼠膝关节实验性骨关节炎软骨细胞凋亡的影响，检测Bax和Bcl-2mRNA表达的变化，旨在研究复元胶囊对骨关节炎的治疗作用，探讨其作用机制。
       1 材料与仪器
       1.1 药物复元胶囊由人参、淫羊藿、鹿茸、黄芪、川芎、当归、枸杞子等组成，委托重庆希尔安药业有限责任公司制成胶囊，仅供实验使用;壮骨关节丸，由深圳三九药业股份有限公司生产，批号：Z44023377。
       1.2 动物雄性成年SD大鼠48只体质量(200～250 g)，由重庆医科大学实验动物中心提供，实验动物生产许可证号：SYXK(渝)2002007。
       1.3 试剂TUNEL试剂盒购自美国Roche公司;蛋白酶K购自美国sigma公司;DAB显色试剂盒购自北京金桥中衫生物技术有限责任公司;RNA提取试剂TRIZOL购自Invitrogen公司;两步法RT-PCR试剂盒购自TaKaRa公司;P53、caspase-3及内参GAPDH引物购自上海Sangon公司(引物序列见表1);DL2000型DNA Maker购自TaKaRa公司;DEPC水，sigma公司;琼脂糖粉购自北京金桥中衫生物技术有限责任公司;GoldViewTM核酸染料购自北京赛百盛公司。
       1.4 仪器HITACHI-7500型透射电镜，日本HITACHI公司产品;BX40型光学显微镜，日本OLYMPUS公司产品;PCR 仪，德国EPPENDORF公司产品;BIO-RAD电泳仪，美国BioRad公司产品;BIO-RAD凝胶成像仪：美国BioRad公司产品。
       2 方法
       2.1 动物分组48只SD大鼠随机分成4组，分别为正常组、模型组、壮骨关节丸组以及复元胶囊组，每组12只。表1 Bax、Bcl-2和内参GAPDH的引物序列
       2.2 建立动物模型除正常组外，其余各组参照Hulth造模型方法[3]。0.5%的水合氯醛按0.35 g/100g腹腔注射麻醉大鼠，在无菌条件下切断右膝内侧副韧带、切除内侧半月板以及剪断前交叉韧带，逐层缝合，无菌包扎。术后每天肌注青霉素2×104 U/kg，共3 d。1周后，每天驱赶大鼠跑步30 min，共3周。
       2.3 给药根据Meeh-Rubner公式计算大鼠的给药剂量。手术后第4周，复元胶囊组给予复元胶囊0.72 g·kg-1·d-1(相当生药5.76 g/kg/d)、壮骨关节丸组给予壮骨关节丸1.14 g·kg-1·d-1配制成3 ml溶液，正常组、模型组分别给予生理盐水3 ml，每天灌胃1次，共8周。
       2.4 取材全部动物在12周末处死，立即解剖右侧膝关节，锐刀片切取1 cm×1 cm×1 cm大小股骨内髁全层软骨，立即放入4℃ 2.5%的戊二醛中固定，供透射电镜观察用(透射电镜制作和观察在重庆医科大学电镜实验室完成)。再每组随机取5只大鼠切取股骨内髁于4%的多聚甲醛溶液中固定，供石蜡切片使用。余下软骨和胫骨平台的软骨用锐刀片切取，装入冻存管液氮中保存，用于RT-PCR检测。
       2.5 TUNEL法检测软骨细胞凋亡参照Roche公司TUNEL试剂说明书操作，并设立阴性对照。阳性判定：细胞核中有棕黄色颗粒者为TUNEL阳性细胞，即凋亡细胞。每张切片任取5个视野，高倍镜下计数阳性细胞和总细胞数，细胞凋亡指数(AI) =TUNEL标记阳性细胞数/软骨细胞数×100%。
       2.6 RT-PCR法检测Bax、Bcl-2mRNA表达用TRIZOL提取各组软骨的总RNA。各组取1 μl总RNA，逆转录合成cDNA，逆转录反应体系总体积10 μl(含MgCl2 2 μl，10×RT Buffer 1 μl， RNase Free d H2O 3.75 μl， dNTPMixture 1μl ，RNase Inhibitor0.25 μl，转录酶0.5 μl，Oligo酶0.5 μl)。取逆转录产物3 μl进行PCR循环(94℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共32个循环，末次延伸10 min， 4℃保存)。反应完毕，取反应产物10 μl于1.5%含50 μl /L GoldViewTM核酸染料琼脂糖凝胶中进行电泳，BIO-DRA凝胶成像仪中紫外光下观察拍照，用Quantity One凝胶图象分析软件检测各组目的基因及其GAPDH基因的光密度值，计算二者的比值，以此作为各组mRNA的相对表达量。
       2.7 统计学处理各组数据以±s表示，应用SPSS10.0统计软件，采用单方向方差分析(One-Way ANOVA)进行统计分析，组间均数采用SNK-q 检验。
       3 结果
       3.1 透射电镜下观察软骨细胞超微结构正常软骨细胞核完整，核膜清晰，核内染色体均匀分布，粗面内质网呈层状排列，线粒体散在分布、细胞表面有许多微绒毛突起。见图1A。凋亡细胞体积明显缩小，突起消失，细胞从周围软骨基质退缩，核膜发生皱褶，染色体浓集，胞质密度增高，有典型的凋亡小体，内有细胞器，细胞周围可见脱落的凋亡小体。见图1B。
       3.2 TUNEL法检测软骨细胞凋亡情况凋亡的软骨细胞核呈棕黄色，主要分布在软骨的浅层和中层。正常组阳性细胞表达最低;复元胶囊组和壮骨关节丸组凋亡指数明显低于模型组，复元胶囊组和壮骨关节丸组比较，复元胶囊组低于壮骨关节丸组。见图2和表2。图1 软骨细胞超微结构(透射电镜，600×)正常组 模型组壮骨关节丸组 复元胶囊组图2 TUNEL法检测各组凋亡软骨细胞(光镜，400×)
       3.3 软骨细胞Bax和Bcl-2mRNA的表达各组软骨提取的RNA经逆转录并扩增后，电泳显示不同的荧光强度(见图3)。图象分析结果(见表3)显示，模型组Bax mRNA表达均显著增加，与正常组、壮骨关节丸组和复元胶囊组比较，差异有显著统计学意义(P<0.01);模型组Bcl-2mRNA的表达低于复元胶囊组(P<0.05)，复元胶囊组Bax的表达比壮骨关节丸组弱，而Bcl-2mRNA的表达比壮骨关节丸强，差异有统计学意义(P<0.05)。模型组Bax/Bcl-2比值明显高于正常组、壮骨关节丸组和复元胶囊组(P<0.01)。表2 TUNEL法检测软骨细胞凋亡指数比较图3 各组软骨细胞Bax和Bcl-2mRNA的表达表3 各组软骨细胞Bax和Bcl-2mRNA的表达及Bax/Bcl-2比值
       4 讨论
       OA在祖国医学属于“痹证”“骨痹”范畴，肾元亏虚、肝血不足、气虚血淤是导致本病的根本内因。复元胶囊具有补益肝肾，益气活血之功效，我们前期研究发现，复元胶囊可促进软骨细胞的增殖、DNA及胶原合成，从而对OA软骨退变有一定防治作用[4]。本研究从OA软骨细胞凋亡的角度研究复元胶囊的作用，探讨其治疗OA的作用机理。
       细胞凋亡(apoptosis)是一种由基因控制的、主动地去除非需要或损伤细胞的程序性死亡过程，然而，过度凋亡则是病理性的和有害的。本实验结果显示，透射电镜下可观察到典型的凋亡形态，包括细胞体积缩小、染色质凝聚、核碎片、细胞皱缩、凋亡小体等;细胞凋亡末端原位检测(TUNEL)发现，经Hulth法建立的OA动物模型关节软骨有凋亡细胞阳性表达，主要位于浅层和中层，再次证明软骨细胞凋亡参与了OA的病理改变。
       细胞的凋亡与细胞的增殖、生长、分化一样，是细胞生长发育的一种过程，这个过程被多种基因所调控。Bax和Bcl-2是一对正负调节因子， Bax/Bcl-2的比值与决定细胞接受刺激信号后存活与否有关， Bax/Bcl-2比值降低，则抑制细胞凋亡，反之，则促进细胞凋亡。许多研究已证实，在细胞凋亡异常的疾病中，存在着Bax/Bcl-2比例的异常，即促凋亡因子Bax和凋亡抑制因子Bcl-2两者失衡[5]。
       本研究发现，模型组细胞凋亡指数的增加伴随Bax表达的增加，说明Bax是促使关节软骨凋亡的重要因素之一。同时，软骨细胞凋亡指数的升高也伴随Bcl-2表达的增加，可能反应了机体对凋亡的一种调控，通过上调细胞凋亡抑制因子，保护软骨细胞免受凋亡，这可能是OA病理过程进展缓慢的一个重要原因[6]。而且，造模后的软骨细胞凋亡指数的增加与Bax/Bcl-2比值明显升高相关。
       现代药理学研究发现，组成复元胶囊的药物中，鹿茸的有效成分鹿茸多肽、川芎的有效成分川芎嗪能抑制软骨细胞过度凋亡[7，8]，人参、淫羊藿、黄芪、枸杞子有抗氧化、延缓衰老的作用。本研究表明，复元胶囊通过降低促凋亡因子Bax表达，增加凋亡抑制因子Bcl-2的表达，并调节Bax/ Bcl-2的比值减少骨关节炎软骨细胞过度凋亡，从而延缓骨关节炎软骨退行性改变过程。
       【参考文献】
         　[1] Kim DY，Taylor HW，Moore RM.Articular chondrocyte apoptosis in equine osteoarthritis[J].Vet J，2003，166(1)：52.
       
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