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       【摘要】 
       目的实验研究肾气丸对D-半乳糖致衰大鼠小肠黏膜内CD4+T细胞、CD8+T 细胞的影响，探讨肾气丸延缓衰老作用。方法30只雄性Wistar大鼠随机分成4组，实验组(高、低剂量组)和模型组用D-半乳糖颈部皮下注射，实验组同时灌服肾气丸，对照组、模型组给予等量的生理盐水灌胃，持续42 d，分别取十二指肠、空肠、回肠，用免疫组化SP法显示黏膜内CD4+T细胞、CD8+T 细胞，分别对黏膜上皮和固有层内的阳性细胞计数。结果模型组与对照组比较，上皮和固有层内CD4+T细胞有显著差异(P<0.05);高剂量组或低剂量组与对照组比较，上皮和固有层内CD4+T细胞也有显著差异(P<0.05);CD8+T 细胞在模型组和实验组与对照组比较，均无明显差异(P>0.05)。结论肾气丸能改善衰老大鼠小肠黏膜内免疫细胞功能状态。
       【关键词】  肾气丸; 衰老; 大鼠; CD4+T细胞; CD8+T细胞
       人体衰老是人类梦想突破的生命瓶颈，其机制极为复杂。在历代医家对衰老机制的论述中，肾、脾虚证是中医学衰老理论的支柱[1，2]，而免疫衰老学说则受到现代医学研究者的普遍赞同[3～5]。肾气丸是《金匮要略》中治疗肾虚证的经典方，此方明为补肾阳，实则阴中求阳，阴阳双补，肾虚得复，元气充足，以御外邪。本研究采用D-半乳糖(D-gal)衰老大鼠模型，观察肾气丸对其小肠黏膜免疫功能的影响，从黏膜免疫角度初步探讨肾气丸延缓衰老的作用。
       1 材料
       1.1 动物与分组选用清洁级Wistar大鼠30只，体质量180～200 g，雄性，购于南昌大学医学院动科部，随机分为4组：对照组(正常组)，模型组(亚急性衰老动物组)，实验组2组(亚急性衰老肾气丸治疗组，分高、低剂量组)，每组10只。
       1.2 药物与试剂肾气丸(由干地黄，山药，山茱萸，泽泻，茯苓，牡丹皮，桂枝，附子8味中药按8∶4∶4∶3∶3∶3∶1∶1的比例按传统方法煎煮过滤，并于恒温水浴锅中浓缩成每毫升含生药1.35 g);D-半乳糖购于北京蓝博斯特生物技术有限公司;兔抗大鼠CD4，CD8(Santa Cruz公司产品)，SP试剂合、DAB-H2O2显色液(北京中杉金桥生物有限公司产品)。
       2 方法
       2.1 动物衰老模型造模方法[6] 及标本制备取清洁级Wistar大鼠，体质量180～200 g，颈背部皮下注射D-半乳糖100 mg/(kg·d)，1次/d，连续42 d，造成大鼠衰老模型，正常对照组无菌操作颈背部皮下注射生理盐水。在造模的同时，实验组分别灌胃相应浓度药物，高剂量组13.5 g/(kg·d)，低剂量组3.37 g/(kg·d)。正常对照组、D-半乳糖模型组用等量生理盐水灌胃。第42天断颈处死，立即在距胃与十二指肠交界处约2.5 cm处，(15±2.5) cm处，距回盲部约2.5 cm处各取2段长约0.5 cm肠管，盐水冲洗，Bouin’s液固定24 h，常规脱水透明，石蜡包埋，备用。
       2.2 免疫组织化学SP法蜡块切片(每一组织块切2张，间隔50 μm，用于CD4、CD8染色)片厚5 μm，切片脱蜡至水。微波修复抗原10 min，3% H2O2甲醇溶液孵育10 min消除内源性过氧化物酶的活性。滴加A液，室温孵育30 min，倾去A液。滴加一抗(CD4稀释度1：100，CD8稀释度1：100)4℃冰箱过夜。滴加B液，室温孵育30 min。滴加C液，室温孵育30 min。DAB-H2O2显色，苏木精复染，常规脱水透明，封固。对照实验采用正常血清和PBS代替一抗，其余步骤同上。
       2.3 观察方法CD4+T细胞、CD8+T细胞卵圆形，胞体可见突起。计数以胞质内出现棕黄色颗粒为阳性细胞：CD4+T细胞位于黏膜固有层及上皮内，固有层分部细胞散在或成团;上皮内阳性细胞多散状分布，常位于上皮细胞核下水平或上皮细胞之间，核上水平较少(见图1)。CD8+T 细胞分布区域与CD4+T细胞相同，但固有层内阳性细胞多散在分布，成群较少，上皮内阳性细胞散在分布，多位于上皮细胞核上水平，核下水平及上皮细胞间少见(见图2)。A-模型组;B-实验组;C-对照组　　图1 十二指肠内CD4+T细胞(免疫组织化学SP法，×400)
       2.4 细胞计数在olympua BH-2型显微镜下观察，拍照，并对每张切片随机取5个(400×)视野下，以100个上皮细胞所含阳性细胞进行计数，结果以±s表示，利用 SPSS13.0软件进行数据分析，组间比较采用t检验。
       3 结果
       3.1 一般情况的观察结果正常组大鼠精神好，行动敏捷;毛发光泽、顺滑;皮肤弹性好;大便成形，呈黄褐色，无腥臭。模型组大鼠体重明显下降、消瘦;倦怠、嗜卧;大便溏泻，肛周有污物;大鼠蜷缩、聚堆;食欲明显下降;大鼠毛色干枯不荣。实验组大鼠上述表现较模型组有良性逆转，与正常组大鼠比较，外形基本无变化，活动频率如常，摄食尚可，大便为深褐色软便。
       3.2 CD4+T细胞、CD8+T 细胞计数结果模型组较对照组，上皮及固有层内CD4+T细胞计数有显著差异(P<0.05);高剂量组或低剂量组与对照组比较，上皮和固有层内CD4+T细胞也有显著差异(P<0.05);高剂量组与低剂量组比较无明显差异(见表1)。CD8+T 细胞在模型组和实验组与对照组比较，均无明显差异(P>0.05)(见表2)。A-模型组 B-实验组 C-对照组图2 空肠内CD8+T细胞(免疫组织化学SP法，400×)表1 不同小肠上皮和固有层内CD4+T细胞数(个/100个上皮细胞表2 不同小肠上皮和固有层内CD8+T细胞数(个/100个上皮细胞
       4 讨论
       在现代医学众多衰老的学说中，衰老的免疫学理论占有重要地位。资料表明，衰老动物的免疫器官萎缩和免疫细胞数量下降[7]，但有关衰老对肠黏膜免疫细胞的研究，目前还未见报道。本组资料显示衰老对大鼠小肠黏膜T细胞亚群有一定的影响，模型组与正常对照组比较，小肠黏膜内CD4+T细胞明显减少，提示衰老可降低小肠黏膜的局部免疫功能。
       中医认为肾虚证为衰老的主要原因/机制。肾虚，则必然引起机体正气的不足，影响机体的代谢能力，造成清除有害氧化物自由基的能力下降，出现病理产物的积累，致细胞老化，组织退行性病变等。本文以中医治肾虚证为切入点，以肾气丸为工具药，从黏膜免疫的角度，开展了中医抗衰老的实验研究。实验表明，肾气丸可对D-半乳糖所致亚急性衰老大鼠的小肠黏膜免疫指标施加影响，明显提高衰老大鼠小肠黏膜内CD4+T细胞的数量，从而提示肾气丸可提高大鼠肠黏膜局部免疫功能，延缓衰老。
       【参考文献】
         　　[1] 姚建平. 虚实与衰老[J]. 辽宁中医杂志，2004，31(6)：458.
       
       [2] 闫润红，李瑞.试论肾虚与衰老[J].山西中医学院学报，2006，17(5)：8.
       
       [3] 江 明，李 棋，李庆阳，等.老年脾、肾虚与细胞免疫关系研究[J] .江西中医学院学报，2000，12(3)：123.
       
       [4] 史进方，顾国浩.免疫衰老及其免疫学预警指标[J].现代免疫学，2005，25(4)：347.
       
       [5] Brink TC， Regenbrecht C， Demetrius L， et al. Activation of the immune response is a key feature of aging in mice[J].Biogerontology. 2009，10(6)：721.
       
       [6] 邹移海，徐志伟，苏钢强，等.21世纪高等医学院校教材实验动物学[M]，北京：科学出版社，2004：125.
       
       [7] 谢红林，方艳辉，陈志杰，等.衰老大鼠细胞免疫功能的变化及中药天年饮的延缓衰老作用[J].时珍国医国药，2007，18(10)：2393.