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       【摘要】 
       目的研究不同炮制方法对附子中3种双酯型生物碱含量的影响。方法分别采用江西建昌帮煨制法、樟树帮法与《中国药典》方法制备附子炮制品，以高效液相色谱(HPLC)方法测定其中新乌头碱、乌头碱与次乌头碱含量。结果不同的附子炮制品中新乌头碱、乌头碱与次乌头碱的平均质量分数(ωB)分别为：建昌帮煨制法：(2.11±0.28)μg·g-1，(6.70±0.19)μg·g-1，(11.24±0.93)μg·g-1;樟树帮法：(2.35±0.37)μg·g-1，(3.21±0.89) μg·g-1，(8.05±0.90)μg·g-1;中国药典法：(1.41±0.16)μg·g-1，0，(1.64±0.21)μg·g-1。结论建昌帮煨制附子中3种双酯型生物碱含量的总量高于其他两种方法，为研究建昌帮炮制技术提供了实验依据。
       【关键词】  中药炮制; 建昌帮; 附子; 双酯型生物碱; 高效液相色谱
       附子为毛莨科植物乌头Aconitum carmichaeli Debx.的子根加工品，药性辛、热，有大毒，具有回阳救逆、补火助阳、散寒止痛的功效[1]，临床主要以炮制品应用为主。由于附子炮制方法甚多，工艺也不统一，由此造成附子饮片质量良莠不齐，严重影响了附子临床应用的安全与有效。本文采用江西建昌帮煨制法、樟树帮法与《中国药典》方法等3种方法炮制附子，并研究比较了不同附子炮制品中3种双酯型生物碱的含量差异。
       1 仪器与材料
       1.1 仪器岛津LC-10ATvp高效液相色谱仪(岛津公司);N2000色谱数据工作站(浙江大学智能信息工程研究所);Tu-1901型紫外可见分光光度计(北京普析);METTLER- TOLEDD AB265-S型电子分析天平(瑞士)。
       1.2 材料附子药材购自江油中坝附子科技发展有限公司，经本校李秀英副教授鉴定为毛莨科植物乌头 Aconitum carmichaeli 的子根加工品;辅料：甘草、皂角由本校标本陈列室提供，生姜、黑豆、薯粉购自食品综合超市;对照品：新乌头碱(110799-200404)、乌头碱(110720-200410)、次乌头碱(110798-200404)，购自中国药品生物制品检定所;试剂除HPLC用乙腈为色谱纯外，其他均为分析纯。
       2 方法与结果
       2.1 附子炮制品的制备
       2.1.1 建昌帮煨附子取盐附子，洗净，用清水浸漂至盐分去尽后，取出，晾干。然后均匀平铺于细糠灰中，上面覆盖一层净生姜片，生姜片上平覆盖2张草纸，纸上在铺一层净细糠灰，灰上平铺少量稻草、干糠壳。然后再于四角点火引燃，待糠烬灰冷，取出附子，再蒸8～10 h，取出，日摊夜闷至半干，切纵薄片，晾晒干。
       2.1.2 药典法黑顺片取泥附子洗净，浸入食用胆巴水中数日，连同浸液煮至透心，捞出，水漂，纵切成厚约0.5 cm的片，再用水浸漂，用调色液使附子染成浓茶色，取出，蒸到出现油面、光泽后，烘至半干，再晒干或继续烘干。
       2.1.3 樟树帮黑顺附取盐附子，削去粗皮，用米泔水浸渍后再用清水浸漂，然后加水、甘草、黑豆、皂角同放入锅内，用文火煮至中央无白心为度。捞起拣尽辅料，晒至七成干，放入缸内闷润2 d，切成4分厚直片，加薯粉及少许清水，拌匀，置木甑内蒸4h，放凉，使附片表面“结面”，用文火烘干。
       2.2 溶液的制备
       2.2.1 混合对照品溶液的制备精密称取新乌头碱、乌头碱、次乌头碱对照品适量，加甲醇制成每毫升分别含16，25.6，32.1 μg的混合对照品溶液，备用。
       2.2.2 供试品溶液的制备称取生附子粗粉约0.1 g，盐附子粗粉约2 g及附子炮制品粗粉约3 g，精密称量，分别置150 ml具塞锥形瓶中，加入浓氨水3 ml润湿0.5 h，加入乙醚100 ml密塞，放置过夜，次日超声15 min，过滤，再以30 ml乙醚分次洗涤滤渣过滤，合并滤液和洗液，40℃水浴挥干，甲醇溶解残渣并定容至2 ml，摇匀，临用前用0.45 μm微孔滤膜滤过，备用。
       2.3 色谱条件色谱柱为Venusil XBP-C18柱(5 μm，4.6 mm×250 mm);流动相为乙腈-20 mmol·L-1NaH2PO4(磷酸调pH4.0)(50:50)(内含10 mmol·L-1十二烷基硫酸钠);流速1.0 ml/min;检测波长235 nm;柱温35℃。精密吸取“2.2”项下混合对照品溶液10μl，供试品溶液各20μl进行色谱分析，记录色谱图。结果见图1。a新乌头碱、乌头碱、次乌头碱对照品 b生附子c盐附子 d建昌帮煨附子 e樟树帮黑顺附 f中国药典黑顺片图1 高效液相色谱图
       2.4 线性关系考察分别精密吸取混合对照品溶液1，2，4，6，8，10 ml置10 ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，分别精密吸取20 μl，依次注入液相色谱仪，测定。以进样量X(μg)对峰面积A进行线性回归，回归方程分别为：新乌头碱：A= 683 834X - 216.28，r=0.999 8;乌头碱：A= 816 632X - 520，r=0.999 8;次乌头碱：A=651 136X - 811.65，r=0.999 9。可知新乌头碱在0.032～0.32μg，乌头碱在0.0 512～0.512μg，次乌头碱在0.064 2～0.642μg范围内峰面积与进样量呈良好线性关系。
       2.5 精密度实验吸取同一浓度的混合对照品溶液20 μl，重复进样测定5次，记录色谱图，结果新乌头碱、乌头碱、次乌头碱峰面积的RSD分别为0.89%，0.10%，0.85%。
       2.6 稳定性实验精密称取生附子样品0.1 g，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，于室温放置0，2，4，8 h和24 h后分别取样测定，结果新乌头碱、乌头碱、次乌头碱峰面积的RSD分别为1.38%，1.10%，1.97%。表明供试品溶液在24 h内稳定。
       2.7 重复性实验精密称取生附子样品0.1 g 5份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，依法测定，结果样品中新乌头碱、乌头碱、次乌头碱的质量分数(ωB)分别为597.904，100.876，585.072 μg·g-1，RSD分别为1.87%，1.47%，1.51%。2.8 加样回收率实验精密称取6份已知含量的生附子样品0.05 g，每份分别精密加入每毫升含新乌头碱、乌头碱、次乌头碱为30.4，6.2，29.8 μg的混合对照品溶液1 ml，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，依法测定。结果新乌头碱、乌头碱、次乌头碱平均回收率分别为：97.95%，RSD1.97%;97.41%，RSD1.08%;97.72%，RSD104%。
       2.9 样品含量测定分别精密称取生附子、盐附子及3种不同炮制方法制备的附子炮制品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液。精密吸取混合对照品溶液10 μl，各供试品溶液20 μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。用外标法，以峰面积计算样品中新乌头碱(mesaaconitine)、乌头碱(aconitine)、次乌头碱(hypaaconitine)的质量分数(ωB)。结果见表1。表1 样品中3种双酯型生物碱含量测定结果
       3 讨论
       水制法与火制法均可促使附子中毒性较强的双酯类乌头碱分解，但水制法易损失有效成分，而炮、煨等火制法不但能降低附子的毒性，而且在避免有效成分的流失、保存药效等方面有优势。本实验结果表明，建昌帮煨制法对附子中所含双酯型生物碱的含量影响最小。
       生附子毒性最大，其强心作用和耐缺氧作用最强，而其中主要成分乌头碱经水解后的产物乌头原碱的毒性仅为原生物碱的1/2000～1/4 000[2]，其强心作用明显减弱。目前，《中国药典》Ⅰ部(2005版)仅规定了附子中乌头碱含量的上限，导致市场中附子饮片的双酯型生物碱含量偏低且相差较大。有文献指出附子有炮制过度的倾向[3]，这无疑会影响到附子饮片的临床疗效。本课题组也将从药效学与急性毒性等方面，对以上3种不同炮制方法制备的附子炮制品作进一步研究。
       在炮制过程中加入了红糖及植物油等调色，使药典法黑顺片的收率比其他两种方法制备的饮片收率高约50%。在供试品制备过程中，由于黑顺片中吸附有植物油而导致其提取液在水浴上难以挥干，可能影响了3种酯型生物碱的提取效率。
       【参考文献】
         　[1] 国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部[S]. 北京:化学工业出版社，2005：132.
       
       [2] 杜贵友，方文贤.有毒中药现代研究与合理应用[M].北京:人民卫生出版社,2003:561.
       
       [3] 陈彦琳，杜 杰，梁 焕，等.道地药材附子炮制加工规范化探讨[J].中国现代中药，2009,11(7):42.