文章标题 全文   多个检索词，请用空格间隔。

       【摘要】 
       目的以致敏大鼠血清免疫球蛋白E(IgE)和白三烯(LT)、全血和肺泡灌洗液(BALF)中的嗜酸性粒细胞(EOS)及肺组织炎症面积为活性指标，跟踪研究西南山茶叶抗IgE介导I型过敏的有效部位和有效成分。方法西南山茶叶用95%乙醇提取,提取物用石油醚、醋酸乙酯萃取，醋酸乙酯萃取物进行化学分离。用卵白蛋白(OVA)和氢氧化铝[Al(OH)3]的混合液致敏和诱发,制成I型过敏反应动物模型。将实验动物随机分组即正常组,模型组，孟鲁司特钠(Menglusitena)组,各样品的低、高剂量组。采用ELISA法测定致敏大鼠血清IgE和LT含量;采用细胞计数法，检测大鼠全血和BALF中EOS数量;通过病理学检查，检测肺组织炎症面积。结果得到95%乙醇提取物(总黄酮10.95%,总多酚15.73%)(1)、石油醚萃取物(2)、醋酸乙脂萃取物(总黄酮39.38%，总多酚20.01%)(3)、水层(4)。化学分离得到7个黄酮醇类化合物,其槲皮素(5)含量最高(5g)。1、3、5均可降低血清中IgE和LT含量,强弱顺序为1<3<5;1、3、5均能减少全血和BALF中EOS数量，强弱顺序为1<3<5;1、3、5均可减少肺组织炎症面积, 强弱顺序为1<3<5。结论西南山茶叶抗IgE介导I型过敏反应的有效部位为黄酮醇类酚性成分。有效成分或代表性成分为槲皮素,其活性强度优于孟鲁司特钠。
       【关键词】  西南山茶; 有效部位; 有效成分; 过敏反应; 炎症
       Study of the Effective Part and Constituent from Leaves of Camallia pitardii Coh. St Sealy on the Anti-Allergy of IgE Involved in Type I
       WANG Yongqi,HOU Lei，SHI Liying，TANG Ling，GUO Yu，MU Hongmei，FENG Baomin
       (College of Bioengineering of Dalian University， Dalian， Liaoning 116622，China)
       Abstract：ObjectiveTo track and study the effective part and constituent from leaves of C. pitardii Coh.St.Sealy on the anti – allergy of IgE involved in type I according to the activities with the serum IgE and LT ,EOS in whole blood and BALF ,inflammation in pulmonary tissue of sensitized rats .MethodsThe leaves of C. pitardii were extracted by EtOH petroleum ether and EtOAC in order and the EtOAC extractions were isolated by silica gel colume and HPLC. Rats were sensitized with the mixture of OVA and Al(OH)3 to establish the experimental animal model of type I allergy. The animals were devided into five groups randomly, namely normal group, model group, Menglusitena group, sample (low-and high-dose) groups.The IgE and LT contents in serum of sensitized rats were measured with ELISA method . The inflammatory area in pulmonary tissue through the pathologieal examination. ResultsTo get EtOH extraction(flavone content 10.95%, polyphenol content 15.73%)(1), petroleum ether extraction(2),EtOAC extraction(flavone content39.38%,polyphenol content20.01%)(3),H2O extraction(4).To get 7 flavonols compounds through chemical isolation,among them quercetin(5) content was the highest (5g).1,3,5 could decrease the contents of IgE and LT in serum，the active sequence was 1<3<5;1, 3, 5 could reduce the quantities of EOS in whole blood and BALF, the active sequence was 1<3<5; 1,3,5 could reduce the inflammatory area in pulmonary tissue, the active sequence was 1<3<5.ConclusionThe effective part from leaves of C. pitardii on the anti-allergy of IgE involved in type I is flavonol constituents. The effective constituent is quercetin. It is more excellent than Menglusitena.
       Key words：Camallia pitardii Coh. St Sealy; Effective part, Effective constituent; Allergic reaction; Inflammation
       根据过敏反应发生机制和临床表现, 将过敏反应分为Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ四种类型.其发病机制Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ型为抗体参与的反应， Ⅳ型为致敏T细胞介导的反应。
       西南山茶Camellia pitardii Coh.St.Sealy系山茶科山茶属红山茶组植物，分布于云南、四川、广西、贵州等省、自治区,是山茶属植物中分布最广的品种之一。
       我们对山茶属植物的研究始于2002年[1～13], 在对山茶属植物抗骨质疏松植物雌激素的研究过程中发现山茶属植物普遍含有大量的黄酮醇类酚性成分,其中西南山茶含量最高,引发我们对其抗过敏性哮喘的研究。
       1 材料与仪器
       1.1 动物 Wistar大鼠60只，雄性，170～180 g，购自吉林大学实验动物中心，合格证号：SCXK-(吉)2003-0007。
       1.2 药品 组分1，3，5号，均由本研究组提供;孟鲁司特钠片，杭州默沙东制药有限公司，批号：08040;上述药物用时以5%吐温-80配成混悬液，4℃保存，均灌胃(ig)给药。
       1.3 试剂卵白蛋白，北京鼎国生物技术有限责任公司，Sigma分装，LOT：056K0729;大鼠白三烯(LT)、免疫球蛋白IgE ELISA检测试剂盒，Biowen Co;Ltd Canada， LOT：2008/08/11;瑞氏-姬姆萨染色液，珠海贝索生物技术有限公司，LOT：070202。
       1.4 仪器 680型全自动酶标仪，美国BIO-RAD伯乐公司产品;显微镜，日本OLYMPUS公司。
       1.5 药物的提取与分离西南山茶叶, 粉碎, 用95%乙醇提取, 得乙醇提取物(总黄酮含量10.95%,总多酚含量15.73%)(1)。乙醇提取物依次用石油醚、醋酸乙酯萃取，得石油醚萃取物(2)、醋酸乙酯萃取物(总黄酮含量39.38%, 总多酚含量20.01%)(3)、水层(4) 。对醋酸乙酯萃取物进行化学分离,得到槲皮素(5)。
       2 方法
       2.1 模型建立[14，15]大鼠一次性腹腔注射含卵白蛋白1 mg和氢氧化铝10 mg的生理盐水1 ml，2周后尾静脉注射卵白蛋白15 mg/kg激发哮喘，5～10 min后出现喘促、咳嗽等呼吸道痉挛梗阻症状提示造模成功。1次/d，连续3次。空白对照组注射等体积生理盐水。
       2.2 分组与给药 大鼠随机分组，分别为正常对照组，模型对照组，孟鲁司特钠1 mg/kg组，1，3，5号样品各设高、低两个剂量组。各给药组与致敏前1 h至末次攻击前1 h每天ig给药1次，正常对照组及模型对照组给予同体积5%吐温-80水溶液。
       2.3 测定指标及方法
       2.3.1 外周血IgE与LT检测 大鼠末次攻击后24 h，300 mg/kg水合氯醛腹腔注射麻醉，腹主动脉采血，3 000 r/min离心10min分离血清，按ELISA试剂盒操作要求，以全自动酶标仪于450 nm测定A值，通过标准曲线计算全血IgE、LT含量。
       2.3.2 全血嗜酸性粒细胞计数全血镜下计数白细胞数;全血涂片，瑞氏-姬姆萨染色，镜下进行白细胞分类计数，计数200个白细胞中嗜酸性粒细胞所占百分数，按全血白细胞数×嗜酸性粒细胞(%)，计算嗜酸性粒细胞数量。
       2.3.3 肺泡灌洗液嗜酸性粒细胞计数 大鼠腹主动脉采血处死，消毒后打开胸腔，左侧肺支气管插管，缓慢注入D-Hanks液5 ml，停留10s，缓慢抽回，重复3次，回收液约4 ml，注入消毒试管，1 500 r/min离心15 min，取少量白细胞涂片，按全血方法进行白细胞分类计数，剩余沉淀用4 ml生理盐水稀释，镜下进行白细胞计数，按全血方法计算嗜酸性粒细胞数量。
       2.3.4 组织病理学检查大鼠腹主动脉采血处死后，立即剖去右侧肺组织，10%多聚甲醛固定，石蜡包埋切片，HE染色，镜下观察肺组织病理学改变。
       2.4 统计学处理计量资料以±s表示，方差齐性采用F检验，两组间均数差异性采用t检验(方差不齐时采用t检验校正公式)，P<0.05认为有统计学意义。
       3 结果
       3.1 对过敏性哮喘大鼠血清IgE、LT含量的影响与正常对照组大鼠比较，模型对照组大鼠血清IgE、LT含量明显增高(P<0.01)。不同组分灌胃给药大鼠同对照组比较,均有不同程度依次降低, 5号最强, 3号次之,但较1号为强。结果见表1。表1 对过敏性哮喘大鼠血清IgE、LT含量的影响与正常组比较，##P<0.01;与模型对照组比较，*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001;n=10
       3.2 对过敏性哮喘大鼠全血与BALT中EOS的影响 与正常对照组大鼠比较, 模型对照组大鼠全血与BALF中EOS数明显增高(P<0.01), 同模型对照组比较1，3，5号可使全血中EOS数量明显降低,其中5号作用最强, 3号次之，1号作用不明显; 1号、3号、5号可使BALF中EOS数量明显降低, 其中5号作用最强，3号次之,1号作用不明显。结果见表2。表2 对过敏性哮喘大鼠全血与BALF中EOS数的影响与正常组比较，##P<0.01;与模型对照组比较，*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001;n=10
       3.3 对过敏性哮喘大鼠肺组织病理形态的影响 正常对照组大鼠肺组织结构正常,肺泡内无炎细胞浸润、渗出。 模型对照组的肺泡、肺泡囊、肺胞管明显变小, 肺间质明显增生, 其中以各类成纤维细胞、嗜酸性粒细胞为主，中性粒细胞较少, 肺内未见明显的白细胞渗出和液体渗出。主要表现为成纤维细胞为主的炎症。1，3，5号给药后肺组织面积明显减小, 5号最强,3，1号次之。结果见表3。
       4 讨论
       本实验以卵白蛋白为抗原,复制大鼠过敏性哮喘、炎症模型, 通过特异性IgE的产生、血清炎症介质白三烯含量变化、全血和肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞数量变化及肺组织炎性细胞浸润炎症面积增减, 对西南山茶叶95%乙醇提取物(总黄酮含量10.95%,总多酚含量15.73%)、 乙醇提取物的醋酸乙酯萃取物(总黄酮含量39.38%,总多酚20.01%) 槲皮素的抗IgE介导I型过敏进行了研究。结果表明各项指标依次降低、减少和减小。其中槲皮素作用最强, 优于阳性对照药孟鲁司特钠。由此确认西南山茶抗IgE介导I型过敏的有效部位为黄酮醇类酚性成分,其有效成分或代表性成分为槲皮素。表3 抗过敏性哮喘组分对过敏性哮喘大鼠肺组织炎症的影响IgE 在过敏反应中起重要作用, 机体吸入抗原后产生特异性IgE抗体, IgE与肥大细胞膜上 IgE FC段高亲合力受体结合, 使机体呈致敏状态(图1)[16]。
       组胺、白三烯、血小板活化因子通称为过敏反应三大介质, 但与I型过敏反应相关的是组胺和白三烯, 而与支气管哮喘和过敏性鼻炎密切相关的是白三烯, 它引起肺气管收缩作用比组胺大1 000倍。 活性成分是LTC4.D4.E4，而LTB4能吸引嗜酸性粒细胞, 这些白细胞大量出现在炎症部位, 所以白三烯被称之为IgE介导I型过敏反应的罪魁祸首(图1)[16]。
       图1 过敏反应机理
       嗜酸性粒细胞增多为过敏性哮喘的特征变化,它能产生多种毒性蛋白, 可直接损伤气道上皮和肺组织, 引起气道上皮剥离和气道高反应性[17]。
       孟鲁司特系进口喹啉类合成药是刚刚完成临床观察上市的新药, 也是目前唯一的白三烯拮抗剂。其上市使用后的不良反应是血管性水肿、嗜睡、痛痒、幻觉、烦躁不安、心悸、恶心、呕吐、消化不良、腹泻等。所以努力从天然资源中寻找高效低毒、快速灵敏的白三烯拮抗剂仍然是摆在药学工作者面前的迫切任务。
       【参考文献】
         　　[1] 王永奇,吴小娟, 李红冰,等.药用山茶属植物的研究[J].大连大学学报，2006，27(4):47.
       
       [2] 吴小娟,李红冰,逄 越,等.山茶和油茶种子脂肪酸分析[J].大连大学学报，2006,27(4)：56.
       
       [3] 吴小娟,林红景,唐 玲,等.山茶种子抗骨质疏松有效部位群中化学成分的含量测定[J].中南药学，2007,5(2):107.
       
       [4] 唐 玲，冯宝民，李红冰，等.油茶皂素的研究进展[J].中南药学，2008，6(3)：330.
       
       [5] 陈跃龙,唐 玲,李红冰,等.油茶果皮多元酚富集工艺研究[J].时珍国医国药，2008,19(6):1369.
       
       [6] 李红冰,陈跃龙,石海峰,等.油茶种子抗肿瘤有效部位群化学成分含量的分析方法[J].时珍国医国药，2008,19(7):1610.
       
       [7] 吴小娟,李 剑,刘 芸,等.重组孕激素受体基因酵母法对南山茶子拮抗孕激素作用的研究[J].时珍国医国药，2008,19(8):1817.
       
       [8] 吴小娟,李 剑,刘 芸,等.重组雌激素受体基因酵母法对山茶子抗骨质疏松活性部位的研究[J].辽宁中医杂志，2008,35(7):126.
       
       [9] 唐 玲,葛迎春,刘 平,等.油茶籽提取物对体外培养不同肿瘤细胞增殖的抑制作用[J].辽宁中医药大学学报，2008,10(10):141.
       
       [10] Xiaojuan WU,Ling TANG,Hongjing LIN,et al.Flavonodie from Seeds of Camellia semiserrata Chi And Their Estrogenic Activity[J]. Bioci. Biotechnol. Biochem， 2008,72(9):2428.
       
       [11] 王永奇，林红景，陆敏珠，等.山茶属植物药用研究的最新进展[J].中国药物与临床，2008,8(10):764.
       
       [12] 唐 玲,冯宝民,史丽颖,等.山茶属植物的抗骨质疏松作用[J].中药材，2008,31(10):1540.
       
       [13] 林红景,吴小娟,唐 前,等.正交实验优选南山茶子总黄酮的最佳提取工艺[J].时珍国医国药，2008,19(11):2616.
       
       [14] 崔龙苹. 过敏性哮喘大鼠模型的制备[J].上海实验动物科学，2000,20(2):69.
       
       [15] 郑 茜.天炙血清对过敏性哮喘大鼠外周血和肺支气管中EOS的影响[J].新疆中医药，2008,26(2):12.
       
       [16] 王锐岩. 生物化学，第3版，下册[M].北京：高等教育出版社，2003:280,283,333,89.
       
       [17] 陈 奇.中药药效研究思路与方法[M].北京：人民卫生出版社，2005:358.