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       【摘要】 
       目的探讨时间和剂量对脂多糖(LPS)刺激小鼠腹腔巨噬细胞TLR2/4mRNA表达的影响。方法常规提取和培养小鼠腹腔巨噬细胞。时效实验，加入终浓度为1 μg/ml LPS，分别刺激1，3，6，12 h后取材;量效实验，分别加入终浓度为0.00，0.01，0.1，1，10 μg/ml LPS， 3 h后取材。小鼠腹腔巨噬细胞TLR2/4 mRNA的表达采用RT-PCR进行。结果①在LPS 1μg/ml 剂量下6 h内，随着时间的延长，TLR2/4mRNA的表达量逐渐上升，与空白对照组相比有显著性差异(P<0.05，P<0.01);但刺激时间达12 h时，细胞开始脱壁、死亡。② 在LPS 0.01～1 μg/ml 剂量范围内，随着LPS浓度的增加，TLR2/4mRNA的表达量逐渐上升，呈一定剂量依赖关系，与空白对照组相比有显著性差异，(P<0.05或P<0.01);但当LPS浓度达10 μg/ml，TLR2/4 mRNA的表达量反而下降。结论用LPS体外刺激小鼠腹腔巨噬细胞，在0.01～1 μg/ml浓度范围内，在1～6 h时间内，其TLR2/4 mRNA的表达呈现出一定的时效与量效关系，该研究可为今后的研究者提供有益的时间和剂量参考。
       【关键词】  脂多糖; 腹腔巨噬细胞; Toll样受体2/4; 基因表达
       Effect of LPS on the Expressions of TLR2/4 mRNA in Mouse Peritoneal Macrophage in vitro
       SONG Meifang，JIN Shenrui*，ZENG Nan，SHEN Yingjun
       (Chengdu University of TCM, Chengdu， 611137, China)
       Abstract：ObjectiveTo study the effect of LPS on the expression of mRNA of TLR2/4 of mouse peritoneal macrophage in vitro. MethodsMouse peritoneal macrophage were extracted and cultivated by routine， LPS(1 μg/ml) was used to stimulate peritoneal macrophage in vitro，then the expression TLR2/4 of mRNA were detected by RT-PCR at 1，3，6，12 h respectively. At the same time，LPS(0.001，0.01，0.1，1，10 μg/ml) was used to stimulate peritoneal macrophage in vitro，and the expressions were detected at 3 h point. Results①The expression of TLR2/4 mRNA in peritoneal macrophage was increased within 6 hs at the dosage of 1 μg/ml (P <0.01 or P<0.05)，but the expression was decreased at 12 h point; Within the dosage of 0.01～1 μg/ml，the expression of TLR2/4 mRNA in peritoneal macrophage was increased at 3-hour point(P<0.01;P<0.05)，but the expression decreased at the dosage of 10 μg/ml.ConclusionExpression of TLR2/4 mRNA in mouse peritoneal macrophage with LPS is correlated with time and dosage in vitro. Time is from 1 to 6 h, and dosage is from 0.01μg/ml to 1 μg/ml.
       Key words： Lipopolysaccharide; Peritoneal macrophage; Toll-like receptors 2/4; Gene expression
       脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)可以激活巨噬细胞，促进其产生与释放许多活性物质，导致炎症反应的发生[1，2]。Toll样受体(Toll-like receptor，TLR)[3]是近几年发现的一类天然免疫受体，有10种TLR家族成员，其中与LPS信号传导相关的主要是TLR2和TLR4。现有文献提示，小鼠腹腔巨噬细胞TLR2/4 mRNA的表达随LPS刺激浓度及时间而变化，但目前的资料存在一定的模糊和矛盾，本研究希望通过实验探讨LPS体外诱导小鼠腹腔巨噬细胞TLR2/4mRNA表达的时间与剂量关系。现报道如下。
       1 材料与仪器
       1.1 动物昆明小鼠，雄性，体质量18～22 g，由成都中医药大学实验动物中心提供。动物合格证号：SCXK(川)2008311。
       1.2 试剂LPS(Sigma公司)，RPMI Medium 1640(Invitrogen Corporation)，Fetal Bovine Serum(Invitrogen Corporation)，RT试剂盒(Fermentas)，PCR试剂(广州东盛生物科技有限公司)，琼脂糖(ShanghaiYito Bio-instrument Co.)，Trizol(Invitrogen)，三氯甲烷、异丙醇、无水乙醇(分析纯，成都市科龙化工试剂厂)。
       1.3 仪器 S.SW-CJ-1F净化工作台(上海跃进医疗器械厂)，MCO-15AC型CO2培养箱(SANYO Electric Biomedical Co.Ltd)，倒置相差显微镜(Leica)，TGL-16G-A型低温高速离心机(上海安亭科学仪器厂)，LDZ5-2低速自动平衡离心机(北京医用离心机厂)，DYY-11B型三恒电泳仪(北京市六一仪器厂)，MDF-U50V超低温冰箱(SANYO Electric Biomedical Co.Ltd)，PCR仪(BIO-RAD)，PCR凝胶成像系统(BIO-RAD)，5030-PVL压力蒸气灭菌器(长春百奥生物仪器责任有限公司)。
       2 方法
       2.1 小鼠腹腔巨噬细胞的分离与培养[4，5]小鼠脱颈处死，浸入75%酒精中5 min后，于腹中线处剪开皮肤，暴露腹壁肌肉，用酒精消毒腹膜壁，将无血清1640培养液5 ml注入小鼠腹腔，仰卧平放并轻揉小鼠腹部2～3 min，静置5 min后，使小鼠体倾向一侧，用注射器抽取腹腔液约4～4.5ml，1 500 r/min离心5 min，去上清，用含10%小牛血清的1640培养液进行细胞计数，调整细胞浓度为1×106个/ml(取出一滴细胞悬液经台盼蓝染色，细胞存活率大于99%)，5 ml/瓶接种于25 cm2的培养瓶中，置于37℃，5%CO2培养箱中培养，3 h后更换培养液除去未贴壁细胞，贴壁细胞则为腹腔巨噬细胞。
       2.2 实验分组
       2.2.1 LPS诱导小鼠腹腔巨噬细胞TLR2/4 mRNA表达的时间效应研究小鼠腹腔巨噬细胞培养24 h后，细胞分为空白对照组(加入等量培养液)、LPS刺激组(终浓度为1 μg/ml)，分别在1，3，6，12 h终止培养，弃去培养液，用PBS洗涤细胞后加入Trizol试剂，提取总RNA后进行RT-PCR检测细胞TLR2/4mRNA表达。
       2.2.2 LPS对小鼠腹腔巨噬细胞TLR2/4 mRNA表达的剂量效应研究小鼠腹腔巨噬细胞培养24 h后，细胞分为空白对照组(加入等量培养液)、LPS刺激组(终浓度分别为0.001，0.01，0.1，1，10 μg/ml，等比设立)，3 h后终止培养，弃去培养液，用PBS洗涤细胞后加入Trizol试剂，提取总RNA后进行RT-PCR实验。
       2.3 采用RT-PCR方法检测细胞TLR2/4mRNA表达 用Trizol试剂提取细胞总RNA，按RT试剂盒说明书逆转录并进行PCR扩增。以小鼠β-actin作为内参。引物序列如下：β-actin(288 bp)Forward 5"-GCTACAGCTTCACCACCACAG-3"Reverse 5"-GGTCTTTACGGATGTCAACGTC-3" TLR2(295 bp) Forward 5"-TTTGCTCCTGCGAACTCCTA-3"Reverse 5"-GCTTTCTTGGGCTTCCTCTT-3"TLR4(349 bp) Forward 5"-GGGTCAAGGAACAGAAGCA-3"Reverse 5"-TGAAGGCAGAGGTGAAAGC-3"
       PCR反应条件：94℃预变性5 min;94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，30个循环;72℃延伸10 min。扩增产物在1%琼脂糖凝胶上90 V电压下电泳30 min，凝胶成像系统拍照并分析光密度值，并计算mRNA相对表达量，公式如下：
       mRNA相对表达量=目的基因条带光密度值/对应的β-actin条带光密度值。
       2.4 统计学方法 用《中国医学百科全书·医学统计学》统计软件包PEMS3.1进行。
       3 结果
       3.1 LPS诱导小鼠腹腔巨噬细胞TLR2/4 mRNA表达的时间效应实验结果如表1，图1所示。未受LPS刺激的腹腔巨噬细胞有少量的TLR2、TLR4 mRNA表达。当LPS刺激1 h后，TLR4 mRNA表达明显高于对照组(P<0.05);刺激达3～6 h，TLR2、TLR4 mRNA的表达明显高于对照组，并维持在一个高水平(P<0.01);但12 h后，细胞开始脱壁、死亡，细胞总RNA未能成功提取。表1 LPS诱导小鼠腹腔巨噬细胞TLR2/4 mRNA表达的时间效应与空白对照组比较， *P<0.05， **P<0.01;n=3
       3.2 LPS对小鼠腹腔巨噬细胞TLR2/4 mRNA表达的剂量效应实验结果见表2，图2～3。未受LPS刺激时仅有少量TLR2、TLR4 mRNA表达;随浓度的增加，TLR2、TLR4 mRNA表达显著上升，在LPS浓度为0.01 μg/ml时，与对照组相比显著差异(P<0.05);在LPS浓度为1 μg/ml时，两者表达达到峰值，与对照组相比显著差异(P<0.01);但当LPS浓度上升为10 μg/ml时，TLR2、TLR4 mRNA表达则出现下降。1～4分别代表空白、LPS 1 h、LPS 3 h、表2 LPS对小鼠腹腔巨噬细胞TLR2/4mRNA表达
       4 讨论
       来源于革兰氏阴性菌细胞壁的LPS被用于炎症的研究已有几十年的历史。从大量文献中可发现LPS更多的是被用于炎症模型而非天然免疫模型。LPS可以诱发细胞因子如TNF-α、IL-1β或IL-6所致的许多炎症作用，且比单一的细胞因子更能引起强烈的反应。Toll样受体(TLR)广泛表达在天然免疫系统，它们通过识别保守的病原体相关分子位点(PAMPs)，例如细菌的脂多糖、脂肽，或者细菌和病毒的DNA、RNA等，来识别大量的异己抗原[6]。与LPS作用有关的TLR主要是TLR2和TLR4。TLR2虽不是识别LPS的主要受体，但其可能作为“二级受体”促进炎症反应的发生。TLR4是被研究较多的与LPS信号转导有关的受体[7]。小鼠腹腔巨噬细胞TLR2/4 mRNA的表达随LPS刺激时间和浓度的不同而变化，呈现一定时间、剂量依赖关系，但目前的研究资料存在一定的差异[8～10]，给进一步的研究带来一定的困难。因此，本研究根据相关文献进行了LPS体外诱导小鼠腹腔巨噬细胞TLR2/4 mRNA表达的时效与量效关系，希望为其他研究人员提供一定的参考。
       实验结果显示，LPS在1 μg/ml剂量下随着刺激时间的延长，小鼠腹腔巨噬细胞TLR2/4 mRNA的表达显著上升，且在3，6h时，TLR2/4 mRNA表达达峰值且维持在一个高水平(P<0.01)，但12h时，巨噬细胞变圆开始脱壁、死亡。同时，剂量也对TLR2/4 mRNA表达存在明显的影响，浓度为0.01 μg/ml时腹腔巨噬细胞TLR2/4 mRNA表达明显(P<0.05);浓度为1 μg/ml时，表达达到峰值(P<0.01);但当LPS浓度上升为10 μg/ml时，TLR2、TLR4 mRNA表达反而出现下降。这样的结果与目前的一些文献存在一定差异，提醒后来的研究者加以注意。
       本研究结果表明，用LPS体外刺激小鼠腹腔巨噬细胞，在0.01～1 μg/ml浓度范围内，在1～6 h时间内，其TLR2/4 mRNA的表达呈现出一定的时效与量效关系，可为今后的研究者提供有益参考。
       【参考文献】
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