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       【摘要】 
       目的分析表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)在绿茶提取物中的含量，探讨EGCG对人胃癌细胞BGC823增殖和凋亡的影响，为阐明EGCG抗肿瘤作用机制提供实验基础。方法反相高效液相色谱法(RP-HPLC)测定绿茶提取物中EGCG的含量。MTT法检测EGCG对体外培养的人胃癌细胞BGC823增殖的影响;DNA ladder法检测EGCG处理各组DNA梯度的变化。所有数据均采用SPSS12.0进行统计分析，均数比较采用t-test。结果通过绘制标准曲线确定绿茶提取物中EGCG 的含量为9%。MTT法检测结果显示EGCG能够呈现剂量(5×10-3,1×10-2,2×10-2,4×10-2)g/L依赖性地抑制人胃癌细胞BGC823的增殖;DNA ladder法显示EGCG处理组细胞DNA呈现梯状条带，而对照组则没有这种带纹。结论绿茶提取物中EGCG的含量为9%;EGCG能够通过诱导细胞凋亡而抑制人胃癌细胞BGC823的生长和增殖。
       【关键词】  反相高效液相色谱; 表没食子儿茶素没食子酸酯; 胃癌细胞; 细胞凋亡
       Determination of EGCG in Green Tea and its Inhibitory Effect on Proliferation of Human Gastric Cancer Cell in vitro
       ZHANG Feng1,2, AN Liguo2, LI Furong3, ZHAO Xiaomin1, WEN Jinfu1, YANG Guiwen2*
       (1.Institute of Life Sciences,Taishan Medical College,Taian,271000, China; 2.Laboratory of Animal Resistance,College of Life Sciences,Shandong Normal University,Jinan 250014, China; 3.Department of Research, Taishan Medical College,Taian 271000 ,China)
       Abstract：ObjectiveTo analyze the content of Epigallocatechin gallate(EGCG)in green tea extraction and to investigate the effect of EGCG on the proliferation and apoptosis of human gastric cancer cells BGC823 cultured in vitro,which provide experimental basis for clarifying the mechanism of antitumor effect of EGCG.MethodsIn the condition of mobile phase double distilled water / acetonitrile / ethyl acetate (86∶12∶2 v / v / v), a flow rate of 1.0 ml / min, RP-HPLC Chromatogram was used to study EGCG in green tea. Human gastric cancer cells BGC823 cultured in vitro were treated with different concentrations of EGCG, and then the absorbencyon at 490 nm of the cells in each group was examined by MTT method. DNA ladder assay was used to detect the apoptosis of BGC823.Statistical analysis was performed by SPSS12.0 and t test was used to compare the mean value between the different groups.ResultsThere was 9% EGCG in green tea extraction calculating by drawing standard cure. After treatment with different concentrations of EGCG, as measured by MTT assay ,cell viability decreased in a dose- (5×10-3,1×10-2,2×10-2,4×10-2g/L) dependent manner(showed as figure 2). DNA ladder assay showed that DNA of the cells treated with EGCG showed the characteristics of apoptosis-DNA ladder,while the control group did not have such strip.ConclusionThere was 9% EGCG in green tea.EGCG can inhibit the growth and proliferation of gastric cancer cells BGC823 by inducing its apoptosis.
       Key words：RP-HPLC; EGCG; Gastric cancer cell; Cell apoptosis
       历史上茶曾被作药用。近些年,茶及其组分对人体健康的潜在益处使得对茶的研究越来越广泛。茶尤其是绿茶，含有特殊的多酚物质,主要是儿茶素[1]。儿茶素是以儿茶为主体结构,与没食子酸基团结合形成的一类活性物质,其中表没食子儿茶素没食子酸酯(Epigallocatechin gallate ，EGCG)是绿茶儿茶素中含量最高的一种,占50%左右，其它几种茶多酚化合物在绿茶中的含量相对较低,包括表没食子儿茶素(epigallocatechin,EGC)、表儿茶素没食子酸酯(epicatechin-3-gallate,ECG)和表儿茶素(epicatechin,EC)[2]。研究表明[3，4], EGCG具有很强的抗肿瘤生长、抗癌侵袭转移等活性。此外,它也用作肿瘤多重耐药性的逆转剂,能够改善许多癌细胞对化疗的敏感性并减轻对心脏的毒性[5]。据此我们推测EGCG能够抑制细胞增殖从而抑制胃癌细胞的生长，在胃癌治疗中发挥有益的作用。我们研究日照绿茶中EGCG的含量及其对胃癌细胞增殖的抑制作用，以期探讨绿茶是否也有着广泛的生物学作用，为进一步开发绿茶的应用价值提供基础资料。
       1 材料与仪器
       BGC823细胞株(山东省医学科学院);EGCG(Sigma 公司);RPMI 1640干粉(GIBCO);小牛血清(四季青生物工程材料有限公司);噻唑蓝(MTT)(Sigma公司);青霉素(北京鼎国生物技术发展中心);链霉素(北京鼎国生物技术发展中心);二甲基亚砜(DMSO)(Sigma公司);高效液相色谱分析仪(HPLC)(美国Agilent公司);荧光显微镜 (Leica);DYY-6C型电泳仪(北京六一仪器厂); 微波炉(广东顺德);Model 550 酶标仪( BIO-RAD 美国);凝胶成像系统(Tu-20，美国)。
       2 方法
       2.1 高效液相色谱法测定绿茶中EGCG含量
       2.1.1 高效液相色谱条件色谱柱为C18 ，监测器：紫外监测波长(280 nm);流动相为双重蒸水/乙腈/乙酸乙酯(86∶12∶2 V/V/V)，流速：1.0 ml/min。
       2.1.2 标准曲线的绘制准确称取EGCG 0.010 0 g，用双蒸水溶解于10 ml容量瓶中，经微孔滤膜过滤作为母液，通过梯度稀释得到终浓度为(0.0050，0.0025，0.0013，0.0006，0.0003)g/ml的EGCG待测溶液。
       2.1.3 样品中EGCG含量的测定准确称取绿茶提取物0.010 0 g，用双蒸水溶于10 ml容量瓶中，经微孔滤膜过滤作为待测样品。
       2.2 细胞培养及MTT法检测细胞增殖情况BGC823细胞株购自山东省医学科学院，置于含10%胎牛血清的RPMI -1640培养体系中，在37℃，50 ml/L CO2的饱和湿度培养箱中培养。
       取对数生长期的胃癌细胞BGC823以5×107/L浓度接种于96孔培养板, 每孔100 μl, 37℃, 50 ml/L CO2培养箱中培养。24 h后分别接入不同浓度的无菌EGCG溶液100 μl, 使最终浓度分别为5×10-3,1×10-2,2×10-2,4×10-2 g/L, 各组设8个重复孔, 对照组加100 μl培养液, 在37℃, 50 ml/L CO2条件下继续培养48 h。 实验终止前加入新配制的5 g/L的MTT溶液20 μl,混匀, 再继续培养4 h. 弃去上清液,每孔加DMSO 200 μl,充分振荡30 min, 溶解MTT沉淀物, 490 nm测定每孔的吸光度A值。 计算抑制率: 抑制率(%)=(1-实验组A值/对照组A值)×100%。
       2.3 DNA梯度检测细胞凋亡将1×108/L细胞接种于9个6 cm培养皿中, 24 h后加入无菌EGCG溶液, 使每3皿终浓度为2×10-2, 3×10-2，4×10-2g/L, 对照组加等量的培养液。继续培养48 h,0.25%胰蛋白酶消化，1 000 r/min离心5 min，细胞用1 ml冰冷的PBS重悬，1 000 r/min离心5 min，弃上清液，重复1次，细胞按以下步骤抽提DNA：①加消化缓冲液1ml，再加入蛋白酶K(20 mg/ml)15μl在55℃消化3 h。②1∶1酚/氯仿抽提，离心7 000 r/min，15min。③再用氯仿抽提一次(注意操作动作要轻)。④取上清(不要搅动液面)，移入干净EP管中。⑤加入0.1体积的NaAc，(pH 5.2，5 mol/L),再加入2倍体积无水乙醇，小心混匀，-20℃过夜沉淀DNA，12 000 r/min离心5 min。⑥用70%乙醇洗涤2次，12 000 r/min离心5 min，倒净EP管中乙醇，待乙醇痕量挥发，加入50 μl双蒸水溶解。⑦2%琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡梯度。
       2.4 统计学处理用SPSS12.0统计学软件和t-test处理数据，所有数据均用±s表示。
       3 结果
       3.1 RP-HPLC法测定绿茶提取物中EGCG含量
       3.1.1 EGCG的高效液相色谱图谱见图1。
       图1 标准品EGCG的高效液相色谱图谱
       由图1确定EGCG在实验色谱条件下的保留时间约为9.097min。
       3.1.2 标准曲线的绘制检测各个浓度的EGCG的峰面积，每个浓度重复3次，得回归方程为Y=21222X-688.27[Y为峰面积，X为EGCG浓度(0.3～5.0 mg/ml)]，R2=0.996 5。
       3.1.3 样品中EGCG含量的测定通过与标准品出峰时间对比，可知出峰时间为9.056 min的峰为EGCG。重复3次5 mg/ml样品的高效液相色谱，得样品EGCG峰面积平均值为8766.1，由标准曲线计算可知5 mg样品中EGCG含量为0.45 mg，即绿茶提取物中EGCG含量为9%。
       3.2 MTT法检测细胞增殖情况EGCG对胃癌细胞BGC823的生长有很强的抑制作用，而且呈现明显的剂量依赖性。见图2。
       图2 EGCG对胃癌细胞BGC823的生长抑制作用
       3.3 DNA梯度检测细胞凋亡凋亡细胞由于内源性核酸内切酶的激活, 其DNA在核小体之间的连接处被切断,降解为180～200 bp的或其整倍数的寡核苷酸片段,经琼脂糖凝胶电泳呈现阶梯状条带(DNA ladder) 。(2×10-2, 3×10-2，4×10-2)g/L EGCG作用于胃癌细胞后,采用琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色,可见明显的DNA ladder凋亡带,对照组细胞则无此凋亡梯状条带。见图3。
       4 讨论
       胃癌是我国常见的肿瘤之一, 为全部恶性肿瘤的第3位, 占消化道肿瘤的首位。胃癌的死亡率相当高, 是各种恶性肿瘤中的第1位。虽然近年来胃癌在我国的发病率有降低趋势, 但作为重大疾病, 胃癌的防治形势依旧十分严峻, 亟待发掘新的有效的治疗策略。绿茶是三大茶系之一,绿茶多酚占绿茶干重的30%, 大多数是儿茶素。许多流行病学研究都表明饮用绿茶同众多部位发生肿瘤的危险度偏低相关, 尤其是胃、食管、卵巢和乳腺等[6，7]。实验采用反相高效液相色谱法测定日照绿茶提取物中EGCG含量，确定其中含有EGCG且含量为9%，观察EGCG对人胃癌细胞BGC823的生长抑制作用，发现EGCG能够通过诱导细胞凋亡抑制其生长和增殖。体内实验也显示, 服用绿茶提取物或茶多酚能抑制裸鼠的乳腺癌和前列腺癌的生长[8，9]。流行病学及体内外实验研究结果相辅相成地提示我们绿茶对胃癌治疗可能有一定的疗效。因绿茶饮用在亚洲较为盛行,利用绿茶或绿茶成分预防和治疗肿瘤极具前景。
       EGCG作为绿茶中的主要作用成分，是多效的生物活性物质，具有较强的抗肿瘤作用。它可以通过诱导肿瘤细胞凋亡、抑制端粒酶活性及抑制生长因子介导的细胞分裂素活化蛋白激酶(MAPK)依赖性和酪氨酸激酶依赖性信号转导通路等发挥其作用[10～13]。EGCG用于药用具有毒性小，价格低廉，药源充足等优势，很有开发前景。未来研究方向可着眼于：确定其特异性的靶向分子，提高其体内的新陈代谢及生物利用度，发展同其他抗肿瘤抑制剂的协同作用，提高肿瘤防治和治疗的效率，减小其潜在的副作用等。
       【参考文献】
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