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       【摘要】 
       目的探讨青藤碱( sinomenine ,Sin)对糖尿病大鼠脑缺血再灌注损伤单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量的影响。方法采用高脂高糖饮食加腹腔注射小剂量链脲霉素建立糖尿病大鼠模型，造模成功后将大鼠随机分为假手术组、缺血再灌注组、Sin低剂量治疗组和Sin高剂量治疗组。线栓法建立局灶性脑缺血再灌注模型。Sin低(30 mg/kg)、高剂量(60 mg/kg)治疗组于术前30 min分别给予大鼠腹腔注射。采用酶联免疫吸附实验( ELISA)法检测缺血90 min再灌注24 h大鼠额顶部皮质MCP-1和TNF-α含量的变化，并进行2，3，5-三苯基氯化四氮唑(TTC)染色和HE染色观察脑梗塞体积及病理形态学变化。结果①脑缺血再灌注24h，缺血再灌注组MCP-1和TNF-α含量明显升高，与假手术组比较，差异具有显著性(均P<0.05);与缺血再灌注组比较，Sin高、低剂量治疗组均显著减少MCP-1和TNF-α含量;高、低剂量组之间差异亦具有显著性(P<0.05);②Sin治疗组脑梗塞体积较缺血再灌注组减小，高、低剂量组之间差异亦具有显著性(P<0.05);③Sin高、低剂量治疗组脑组织缺血损伤病理学改变明显轻于缺血再灌注组，Sin高剂量治疗组缺血改变亦轻于低剂量治疗组。结论Sin对糖尿病大鼠缺血再灌注脑损伤具有保护作用，其机制可能与降低缺血再灌注损伤脑组织MCP-1和TNF-α含量，抑制再灌注损伤炎症反应有关。
       【关键词】  缺血再灌注; 单核细胞趋化蛋白-1; 肿瘤坏死因子-α; 青藤碱
       Effect of Sinomenine on the Contents of MCP-1 and TNF-α after Cerebral Ischemic Reperfusion Injury in Diabetic Rats
       WU Lan, ZHOU Suxian, LIU Kaixiang, FENG Junlin
       (The Affiliated Hospital of Guilin Medical College ,Guilin 541002,China)
       Abstract：Objective To study the effect of sinomenine(Sin) on the contents of MCP-1 and TNF-α after cerebral ischemia reperfusion(I/R) injury in diabetic rats.MethodsIn this experiment, rat model of diabetes mellitus was made by high sucrose , fat diet and streptozotion injection.Diabetic rats were randomly divided into 4 groups, namely sham operated group, I/R group,low dose Sin treated group and high dose Sin treated group. The focal middle cerebral artery occlusion(MCAO) model was made by suture-occluded method. Sin were given intraperitoneally to rats 30min before focal cerebral ischemia operation. After 90min MCAO following 24h of reperfusion,we investigated the contents of MCP-1 and TNF-α in ischemic frontal and parietal cortex . HE staining and TTC staining were also investigated. Results①Compared with sham operated group , the contents of MCP-1 and TNF-α were increased at 24h of reperfusion in the ischemic territory(P<0.05). Compared with I/R group, Sin dose-dependently reduced the contents of MCP-1 and TNF-α (all P<0.05).②Compared with I/R group,cerebral infarction volume in low and high dose Sin treated groups was decreased dose-dependently (all P<0.05). ③The change of ischemic impairment in low or high dose Sin treated group was lighter than that of I/R group,and high dose Sin treated group was lighter than that of low dose Sin treated group.ConclusionSin may reduced cerebral ischemia-reperfusion injury by decreasing the contents of MCP-1 and TNF-α in diabetic rats.
       Key words：Ischemia-reperfusion; MCP-1; TNF-α; Sinomenine
       研究发现，白细胞早期穿过血脑屏障进入脑组织是再灌注后炎症反应的核心表现。笔者前期有研究证实[1]，脑缺血再灌注后炎症反应是造成再灌注损伤的主要原因之一。而在糖尿病高血糖情况下，明显加重的缺血性脑损伤可能与炎症反应密切相关。单核细胞趋化蛋白-1 (MCP-1)是与单核/巨噬细胞穿过血脑屏障浸润关系密切的趋化因子。青藤碱sinomenine,Sin是从中药青风藤Sinomenium acutum Rehd etWils中提取的生物碱单体，具有抗炎、免疫抑制、镇痛、降压、抗心律失常等药理作用。已有报道，青藤碱对正常血糖大鼠缺血再灌注脑损伤有保护作用[2]，但其是否对脑缺血再灌注损伤单核细胞趋化蛋白-1 (MCP-1)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量有影响尚未见报道，本实验进行了相关研究。
       1 材料与方法
       1.1 糖尿病大鼠模型建立及实验动物分组健康Wistar大鼠，雄性，清洁级，共65只，体质量(250±30)g(广西医科大学动物实验中心提供)。大鼠喂饲高脂饲料(高脂饲料配方: 1%胆固醇, 10%猪油, 0. 2%丙基硫氧嘧啶, 89%基础饲料[3])。4周后, 单次空腹腹腔注射30 mg/kg链脲霉素(购于Sigma 公司)，继续高糖高脂饲料喂养,于注射后1，2个月测定体质量和血糖[4]。选择非空腹血糖16. 7～25. 6 mmol/L 的大鼠作为造模成功的糖尿病大鼠。经检测模型成功大鼠共60只，将按随机分组原则分为假手术组(15只)、缺血再灌注组(15只)、Sin低剂量治疗组(15只)及Sin高剂量治疗组(15只)。
       1.2 方法
       1.2.1 给药方法Sin低剂量治疗组(30 mg/kg)和高剂量治疗组(60 mg/kg)均于术前30 min分别给予大鼠腹腔注射，假手术组和缺血再灌注组给予等量的生理盐水腹腔注射。缺血再灌注组和Sin低、高剂量治疗组建立脑缺血90 min再灌注24 h动物模型。
       1.2.2 脑缺血再灌注动物模型的建立参照Longa等[5]方法制备大鼠局灶性脑缺血再灌注模型。采用颈外动脉插入线栓法，各组均进行左侧大脑中动脉栓塞。线栓采用石蜡线栓。线栓直径约0.27 mm，插入深度约18 mm，此时线栓头位于大脑中动脉起始部。缺血90 min时，抽提线栓实现再灌注。神经功能缺陷评分：按照 Longa等[5]评分标准，各组分别在再灌注24h进行评分。0分：正常，无神经学征象;1分：动物不能完全神展右前肢;2分：动物右侧肢体瘫痪，行走时向右侧转圈，出现追尾现象;3分：动物行走向右侧跌倒，或动物不能站立或动物打滚;4分：无自发活动，有意识障碍。神经功能缺陷评分在1～3分为造模成功。
       1.2.3 MCP-1和TNF-α含量检测 再灌注24 h，立即将各组5只大鼠断头取脑，冰盘上快速取缺血侧额顶部皮质，用冰冷生理盐水冲洗掉血液，滤纸吸干水分,于低温环境下称重，置于含有冰冷生理盐水的玻璃匀浆器中(匀浆器放入冰浴中)制成质量分数为10%的脑组织匀浆，然后放置于低温离心机中, 4℃离心取上清液，ELISA法测定TNF-α和MCP-1含量。
       1.2.4 TTC染色再灌注24 h，将各组5只大鼠麻醉后开颅取脑。将鼠脑置于-4℃冰箱20 min后，将其切成5等份冠状位切片，置于2%TTC溶液中，水浴、多聚甲醛液固定。用计算机病理图像分析仪及梯形法计算出梗塞灶体积，各脑片梗塞灶体积之和即为梗塞体积。左侧大脑半球梗塞灶区呈白色，主要为额顶部皮质和尾壳核，正常组织呈红色。部分组织表现为由白色向红色过度区(见图1)。
       图1 大鼠脑缺血再灌注24 h TTC染色
       1.2.5 HE染色 再灌注24 h将各组剩余50只大鼠，用生理盐水和多聚甲醛心脏灌注固定，断头取脑，取左侧大脑半球距离嗅球尖端7～11 mm之间5 mm厚组织块，固定、脱水、包埋成蜡块，切片，厚5 μm进行常规HE染色，观察病理形态学改变。见图2～5。
       1.2.6 统计学方法数据处理采用SPSS11.5统计软件进行运算，结果以±s表示,组间差异显著性检验采用方差分析。
       2 结果
       2.1 各组大鼠脑组织MCP-1和TNF-α含量的比较见表1。与假手术组比较，缺血再灌注组缺血侧额顶部皮质MCP-1和TNF-α含量明显增高，差异具有显著性(P<0.05) ;与缺血再灌注组比较，Sin高、低剂量组均可明显降低脑组织MCP-1和TNF-α含量(P<0.05)，且高、低剂量组之间差异具有显著性(P<0.05)。表1 各组大鼠脑组织TNF-α、MCP-1及脑梗塞体积的比较与假手术组比较，△P<0.05;与缺血再灌注组比较，*P<0.05;与Sin低剂量治疗组比较，▲P<0.05
       2.2 各组脑梗塞体积的比较见表1。Sin高、低剂量治疗组梗塞体积较缺血再灌注组减小(均P<0.05)，高、低剂量组之间差异亦具有显著性(P<0.05)。
       2.3 各组缺血侧脑组织病理学改变的比较假手术组脑组织切片可见神经细胞、胶质细胞及毛细血管形态正常，结构完整，锥体细胞核大而圆，核仁明显(图2)。缺血再灌注组呈缺血改变，梗塞区正常组织结构消失，结构不清，间质水肿，有炎细胞浸润;锥体细胞体积缩小，细胞核固缩深染，胞浆嗜伊红。部分细胞坏死，并可见呈筛状坏死的坏死灶(见图2～3)。Sin不同剂量治疗组脑组织缺血改变较缺血再灌注组明显减轻，坏死范围缩小，细胞结构较完整，细胞核固缩少，细胞间质水肿轻，高剂量组与低剂量组之间比较，缺血改变更轻(见图4～5)。
       3 讨论
       防己科植物青藤及毛青藤的干燥藤茎称青风藤，Sin是从中提取的生物碱单体，在治疗类风湿性关节炎等各种风湿病以及心律失常中发挥了较好疗效。梁健等[2]给予青藤碱治疗正常血糖的脑缺血再灌注大鼠，显示青藤碱对缺血再灌注脑损伤有保护作用。但具体机制尚不清楚。本实验结果也表明，糖尿病大鼠脑缺血再灌注损伤给予不同剂量的Sin治疗，可明显减少脑梗塞体积，减轻缺血造成的病理损害，并且高剂量Sin的脑保护效果更显著。
       我们前期研究证实，缺血再灌注脑损伤早期存在中性粒细胞浸润的炎症级联反应过程[1]。单核/巨噬细胞浸润则参与缺血后期的迟发性神经元损伤[6]。单核细胞趋化蛋白-1 (MCP-1)是与单核/巨噬细胞浸润关系密切的趋化因子,是促使单核/巨噬细胞穿越血管内皮细胞，进入损伤脑组织的关键因素。MCP-1是由76 个氨基酸组成的蛋白质，MCP-1在正常脑组织保持极低水平存在。脑缺血后神经元、星形胶质细胞、内皮细胞及单核巨噬细胞/ 活化的小胶质细胞可表达MCP-1。大鼠缺血再灌注后6 h 脑组织MCP-1 水平开始上升，2 d 达到高峰,后逐渐下降，MCP-1 峰浓度为是对侧半球同时间点的49.3倍[6]。缺血脑组织MCP-1表达的增高，诱导单核/巨噬细胞向缺血脑损伤区浸润，参与继发性脑损伤或迟发性神经元损伤。MCP-1也可调节细胞因子分泌，上调ICAM-1等黏附分子表达，介导脑组织损伤。TNF-α则是被激活的巨噬细胞分泌的一种具有广泛生物学功能的多效细胞因子。脑缺血再灌注后，激活的TNF-α能促进星形细胞和浸润的白细胞表达MCP-1[7]，使单核细胞穿越血脑屏障进入脑组织内，而浸润的单核巨噬细胞和小胶质细胞又能加重炎症反应，参与神经元损伤。我们实验结果表明，糖尿病大鼠脑缺血90 min再灌24 h，缺血再灌注组脑组织MCP-1和TNF-α含量明显上升，显示此阶段再灌注损伤由缺血性向炎症性损伤发生了重大转变，单核巨噬细胞等炎症细胞参与了缺血再灌注脑损伤过程。研究发现[8，9]，通过各种措施阻断MCP-1和TNF-α的表达，减少单核/巨噬细胞激活、聚集，可减少缺血性神经元损伤。
       近年来发现Sin具有抑制IL-1β、IL-8和核转录因子表达的作用[10，11]。本研究通过给予Sin治疗糖尿病脑缺血再灌注损伤大鼠，显示Sin可显著抑制缺血再灌注损伤后MCP-1和TNF-α含量的上调，减少再灌注损伤炎症细胞浸润，减轻缺血再灌注损伤炎症反应，高剂量Sin的保护效果更显著。Sin减少MCP-1和TNF-α含量的机制是否与阻断炎症反应的上游信号有关，我们将作进一步研究。
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