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       【摘要】 
       目的对中药醇沉工艺中颗粒沉降过程及其特点进行研究，初步了解不同种类中药醇沉过程中沉降颗粒的基本特点及其关键工艺参数，掌握沉降过程的规律，为醇沉工艺设计及工业化应用提供指导。方法以丹参、苦参和枳壳3种药材为研究对象，采用紫外分光光度法分别测定3种药材提取液醇沉过程中有效成分的保留量，同时测定了沉降颗粒含量、颗粒粒度和沉降速度等参数。结果不同药材有效成分保留量在醇沉过程中都有不同程度的下降;沉降颗粒含量随着静置时间的延长而增加;丹参、苦参和枳壳沉降颗粒的平均粒径分别为36.272，131.820 和0.684 μm，最小粒径分别为2.000，6.325和0.142 μm，平均沉降速率分别为5.04×10-4，1.95×10-4和1.63×10-7 m·s-1。结论中药醇沉时，形成的杂质颗粒有两种沉降方式：一种是自由沉降，另一种是絮凝沉降。应根据不同种类中药醇沉颗粒的沉降过程及其特点进行工艺设计。
       【关键词】  中药; 醇沉工艺; 颗粒沉降过程; 沉降方式; 紫外分光光度法
       Preliminary Study on the Particle Sedimentation in the Process of Alcohol Precipitation of Traditional Chinese Medicine
       LI Yerui, LIU Xuesong, WANG Longhu, JIN Yinchi, CHEN Yong*
       (Institute of Modern Chinese Medicine, College of Pharmaceutical Sciences, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China)
       Abstract：ObjectiveTo study the process of particle sedimentation of alcohol precipitation process of traditional Chinese medicine and its characteristics, and to preliminarily understand the basic characteristics and key technological parameters of the settling particle in the alcohol precipitation process of different kinds of traditional Chinese medicines, and hold the regulation of sedimentation and providing guidance for technology design and industrial application.MethodsSalvia Miltiorrhiza, Radix Sophorae Flavescentis and Fructus Aurantii were used as the experimental materials and UV spectrophotometry was used to determine the effective components of the solution in the process of alcohol precipitation, parameters like the content of settling particulate, the particle size and the sedimentation velocity were also determined. Results The content of the effective components was lower than the original in different levels during the precipitation process. The content of the sedimentation particle increased with the extension of the settling time. The average diameters of particles in each material solution were 36.272 μm, 131.820 μm and 0.684 μm and the minimum diameters were 2.000 μm, 6.325 μm and 0.142 μm respectively, the average sedimentation velocity were 5.04×10-4m·s-1, 1.95×10-4m·s-1 and 1.63×10-7m·s-1. ConclusionThere are two ways for the particulate to sediment in the alcohol precipitation process in traditional Chinese medicine, one is free sedimentation, the other is flocculation sedimentation. Process should be designed according to the particle sedimentation process and its characteristics of different traditional Chinese medicine.
       Key words：Traditional Chinese medicine; Alcohol precipitation process; Particle settling; Sedimentation pattern; UV spectrophotometry
       醇沉工艺的原理是中药有效成分(如生物碱盐类、苷类等)既溶于水又溶于乙醇，用适当浓度的乙醇经一次或多次沉降可以有效地除去粘液质、糊化淀粉、果胶等杂质。通常，当乙醇含量达50%～60%时，可以除去淀粉等杂质;75%时可除去蛋白质等杂质;80%时几乎可以除去全部蛋白质、无机盐类杂质[1]。但是，对于醇沉工艺是否保留了有效成分，除去的都是无效成分，越来越多的文献对此持怀疑态度，认为其还存在诸多不足之处[2～4]。如醇沉工艺流程长、耗醇量大;醇沉时出现的大量沉淀会吸附、包裹部分有效成分而造成损失;所得干浸膏粘度较大，易吸潮，给后期工艺操作带来不便等。
       目前对中药醇沉工艺的研究主要是以有效成分含量为指标进行工艺优化，有关醇沉过程中颗粒沉降的特点和规律以及有效成分包裹损失的机制目前还未见报道。加强醇沉过程机理的研究，找出颗粒沉降的特点及规律不仅有助于从微观方面深入研究醇沉过程，还有助于实现整个醇沉过程的精确控制和连续化操作。本研究以丹参、苦参和枳壳3种药材为试验材料，对醇沉工艺中颗粒沉降过程进行了初步研究。通过了解不同种类中药醇沉过程中沉降颗粒的基本特点及关键工艺参数，初步掌握沉降过程的规律，为醇沉工艺的设计及其工业化应用提供指导。
       1 仪器与材料
       Agilent 1100高效液相色谱仪，Mastersizer 2000激光粒度仪(英国马尔文仪器有限公司)，BT00-300M压力泵(保定兰格恒流泵有限公司)，METTLER AE240电子天平(梅特勒-托利多有限公司)，TGL-16C台式离心机(上海安亭科学仪器厂)，751-GW分光光度计(惠普上海分析仪器有限公司)，THD-06Q低温恒温槽(宁波天恒仪器厂)，JJ-1增力电动搅拌器(金坛市杰瑞尔电器有限公司)，自制带夹套玻璃醇沉罐，酸式滴定管。
       丹参饮片、苦参饮片、枳壳饮片(均由杭州正大青春宝药业有限公司提供)，经浙江大学药学院吴永江教授鉴定符合2005年版《中国药典》Ⅰ部各项下有关规定;原儿茶醛对照品、苦参碱对照品、橙皮苷对照品、柚皮苷对照品(中国药品生物制品检定所，批号分别为110810-200205、110805-200306、110721-200512、110722-200309);95%药用乙醇(丰原宿州生物化工有限公司)，纯净水(杭州娃哈哈)，其余试剂均为分析纯。
       2 方法
       2.1 药材的提取称取丹参200 g，分别加水2 000 ml，煎煮两次，2 h/次，合并提取液浓缩至100 ml;称取苦参200 g，加水2 400 ml，煎煮2 h，药渣再加水1 600 ml，煎煮1.5 h，合并提取液浓缩至200 ml;称取枳壳100 g，分别加70%乙醇1 000 ml，回流提取两次，1.5 h/次，合并提取液浓缩至200 ml。
       2.2 溶液的制备及标准曲线的建立
       2.2.1 丹参[5]精密称取原儿茶醛对照品2.0 mg，置10 ml容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。取各样品溶液0.5 ml，分别置10 ml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀得供试品溶液。
       吸光度-原儿茶醛浓度标准曲线的建立：精密量取原儿茶醛对照品溶液0.25，0.35，0.45，0.55，0.65，0.75 ml，分别置于10 ml容量瓶中，依次加入1 mol·ml-1NaOH 4.0 ml，20%Al(NO3)3 0.25 ml和1%NaNO2 2.5 ml，再加水稀释至刻度，摇匀，静置25 min。取上述溶液，以溶剂为空白，在506 nm波长处测定吸光度A。以原儿茶醛浓度C为纵坐标，吸光度A为横坐标，绘制标准曲线。回归方程为C = 48.852A-0.054 5，r=0.997 8，线性范围5～15 μg·ml-1。
       2.2.2 苦参[6]精密称取苦参碱对照品3.285 mg，置于10 ml容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。取各样品溶液0.5ml，分别置10 ml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀即得供试品溶液。
       吸光度-苦参碱浓度标准曲线的建立：精密量取苦参碱对照品溶液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 ml，分别加水稀释至10 ml，摇匀，静置15 min，取上述对照品溶液，以溶剂为空白，在200 nm波长处测定吸光度A。以苦参碱浓度C为纵坐标，吸光度A为横坐标，绘制标准曲线。回归方程为C=252.51A- 0.649 5，r=0.9993，线性范围3.285 ～16.425 μg·ml-1。
       2.2.3 枳壳[7]精密称取橙皮苷对照品2.2 mg，柚皮苷对照品1.1 mg，分别置于10 ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。取各样品溶液0.5 ml，分别置10 ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀即得供试品溶液。
       吸光度-橙皮苷浓度标准曲线的建立：精密量取橙皮苷对照品溶液0.1，0.25，0.5，1.0，2.0，3.0 ml，分别于10 ml容量瓶中，加1 mol·ml-1NaOH 1.0 ml，再加甲醇稀释至刻度，摇匀，静置25 min。取上述对照品溶液，以溶剂为空白，分别在418，358 nm处测定吸光度A。以橙皮苷浓度C为纵坐标，吸光度A为横坐标，绘制标准曲线。回归方程分别为C418=270.86A418+1.913，r418=0.996;C358=90.892A358+1.590 7，r358=0.997，线性范围2.2～66 μg·ml-1。
       精密量取柚皮苷对照品溶液0.1，0.25，0.5，1.0，2.0 ml，分别置10 ml容量瓶中，加1 mol·ml-1NaOH 1.0 ml，再加甲醇稀释至刻度，摇匀，静置25 min。取上述供试品溶液，以溶剂为空白，分别在418，358 nm处测定吸光度A，以柚皮苷浓度C为纵坐标，吸光度A为横坐标，绘制标准曲线。回归方程分别为C418=38.757A418-0.900 3，r418=0.996 9;C358=87.492A358-0.834 7，r358=0.998 5，线性范围1.1～22 μg·ml-1。
       2.3 取样方法分别取丹参、苦参和枳壳浓缩液各100 ml，分别加200 ml，200 ml，300 ml水稀释，然后分别加入95%药用乙醇进行醇沉，使终点药液乙醇含量分别为：75%，70%和85%。乙醇加完时为起始时间，加完后均搅拌0.5 h，然后静置，每0.5 h取样一次，至2.0 h。
       3 结果
       3.1 丹参醇沉结果丹参醇沉时，其总酚酸保留量在搅拌及静置过程中都有一定程度的降低，沉降颗粒含量随时间的延长而增加，见图 1和图 2。
       3.2 苦参醇沉结果苦参醇沉时，总生物碱保留量在搅拌过程中有所降低，在静置过程中变化很小，基本保持稳定，沉降颗粒含量随着时间延长而增加，见图 3和图 4。
       3.3 枳壳醇沉结果枳壳醇沉时，其总黄酮保留量在搅拌后降低，而在之后的静置过程中基本不变化，沉降颗粒含量随着静置时间的延长而增加，见图 5和图 6。
       3.4 颗粒沉降速度的测定参照文献[8]的方法测定3种药材醇沉液的相对黏度μ，用密度计测定醇沉后各药液的密度ρ，采用浸液法测定3种药材醇沉颗粒的密度ρs，结果见表1。表1 参数测定结果
       2005年版《中国药典》规定，溶液型注射液应澄明，静脉用乳状液型注射液分散球粒度90%应在1 μm以下，不得有大于5 μm的球粒[9]。因此在中药注射液制备工艺中，必须使颗粒沉降完全以保证注射液的质量和安全性。根据醇沉经验可知，醇沉过程中形成的沉降颗粒处于层流区[10]，其沉降速度满足stokes公式：
       ut=d2(ρs-ρ)g18μ①
       式中：ut-颗粒的沉降速度(m·s-1);d-颗粒粒径(m);ρs，ρ-分别为颗粒和药液的密度(kg·m-3);g-重力加速度(m·s-2);u-流体的粘度(Pa·s)。
       分别计算3种药材醇沉液体系中粒径为1μm，5 μm的颗粒的沉降速度。由Mastersizer 2000激光粒度仪测定的颗粒粒度分析报告知，丹参、苦参和枳壳醇沉液中出现的颗粒平均粒径分别为：36.272，131.820，0.684 μm，最小粒径dmin分别为：2.000，6.325和0.142 μm，将最小粒径和表1中对应的参数值分别代入①式，求得各药材醇沉时颗粒的沉降速度，结果见表2。
       假设醇沉罐体高度为1 m，由表2可知，要使各醇沉液体系中大于5 μm的颗粒完全沉降，丹参、苦参、枳壳3种药材需要的静置时间分别为：28.98，61.93，31.82 h，若要使1 μm以上的颗粒完全沉降，丹参和枳壳需要更长的静置时间：181.20，795.92 h，这在实际生产中显然难以实现，因为静置时间越长，能量消耗越大，成本越高。表2 沉降速度结果m·s-1“-”代表该醇沉液体系中不含有相应粒径的沉降颗粒
       4 讨论
       一定浓度的中药水提取液进行醇沉时，随着乙醇加入量的增加，有效成分的保留量逐渐增加，当乙醇总量达到一定值时，再增加乙醇的用量没有进一步的纯化作用。本试验结果表明，搅拌对中药醇沉过程有较大的影响，使药液中有效成分的含量出现不同程度的降低。因此，如何控制适宜的搅拌速度是一个比较重要的工艺问题，有待深入研究。
       本试验是针对某些含有代表性有效成分(如生物碱和黄酮)的中药材展开上述研究，一方面考察这些药材的提取液在醇沉时有效成分和沉降颗粒含量的变化，另一方面通过测定相关参数，采用stokes公式对沉降速度进行了初步计算。本试验的相关结果是今后深入研究醇沉工艺中颗粒沉降过程和包裹损失机制的工作基础。如果希望从固液两相的相平衡来考察醇沉过程中沉降颗粒的行为，还需进一步完善取样方法以及颗粒密度和粒度的测定方法。
       本研究的预试验结果表明，密度较大(大于1.15 g·cm-3)的丹参水提液进行醇沉，随着终点乙醇含量的增加，析出的颗粒逐渐变大，当终点乙醇含量超过70%时，会出现团聚结块现象，形成的胶状沉淀物紧紧黏附在搅拌桨和罐壁上，继续搅拌后在药液中几乎看不到悬浮的杂质微粒，澄明度明显有改善，但药液中总酚酸的含量也有所降低。
       从本试验结果可以推断，在中药醇沉过程中，结合成的杂质颗粒主要有两种沉降方式：一种是絮凝沉降，另一种是自由沉降。当药液密度较小时，丹参、苦参和枳壳的杂质微粒沉降过程相似，都以自由沉降为主，形成的杂质微粒搅拌时均匀分散在药液中，停止搅拌后一段时间后振摇，杂质微粒又均匀分散。当药液密度较大时，苦参和枳壳的杂质颗粒沉降过程没有明显变化。但丹参杂质颗粒的沉降却出现了十分明显的变化，随着乙醇加入量的增加，原来均匀的醇沉液中出现逐渐长大的絮团，并随着乙醇的继续加入，絮团继续长大并结块，同时上层药液逐渐变澄清，澄清液与絮团之间出现一个明显的分界面，可视为以絮凝沉降为主。这种差异可能是由于药材提取液中化学成分的不同而引起的。
       【参考文献】
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