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       【摘要】 
       目的研究青蒿叶、桉树叶、红树植物白骨壤叶乙醇提取物对大蜡螟虫的毒杀作用以及对虫体几丁质酶活性的抑制作用。方法采用室内药液喷虫法测定3种植物乙醇提取物的杀虫活性与抑制几丁质酶活性。结果青蒿、桉树、红树植物白骨壤叶乙醇提取物对大蜡螟24h的校正死亡率分别为(69.00±3.87) %，(53.47±11.63) %，(18.60±6.70) %。对大蜡螟几丁质酶的抑制率分别为(20.33±1.42)%，(20.59±1.72)%，(13.56±1.58)%。结论青蒿叶与桉树叶植物乙醇提取物的杀虫活性与抑制几丁质酶活性显著高于红树植物白骨壤叶乙醇提取物(P<0.05)。
       【关键词】  植物源农药; 大蜡螟; 杀虫活性; 几丁质酶
       Assay of the Insecticidal Activity and Chitinase Inhibitory Activity of Botanical Pesticides
       ZHOU Gui1 , SUN Guosong2, HUANG Kelin2, LIN Runguo2, ZHANG Guihua1, DENG Guanghui1*
       (1.Chemistry and Ecological Engineering College，Guangxi University for Nationalities，Nanning，530006，China; 2 Guangxi Research Institute of Chemical Industry,Nanning, 530004，China)
       Abstract：ObjectiveTo study the effects of southernwood leaves,eucalyptus leaves and mangrove avicennia marina leaves ethanol extracts on the insecticidal activity and chitinase inhibitory activity against Galleria mellonella.MethodsThe insecticidal activity and chitinase inhibitory activity of the three plant ethanol extracts were tested for indoor contact toxicity by using sprinkling method. ResultsThe results showed that after 24 h treatment,the corrected death ratios of southernwood ,eucalyptus and mangrove avicennia marina leaves ethanol extract were (69.00±3.87)%,(53.47±11.63) %,(18.60±6.70) % and the inhibition ratios of chitinase were(20.33±1.42)%,(20.59±1.72)%,(13.56±1.58)%, respectively.ConclusionThe insecticidal activity and chitinase inhibitory activity of southernwood and eucalyptus leaves ethanol extract were higher than mangrove avicennia marina leaves ethanol extract markedly.
       Key words：Botanical Pesticides; Galleria mellonella; Insecticidal activity; Chitinase
       21世纪全球农业发展的一个重要趋势是更加注重农产品质量安全性,倡导安全优质绿色食品[1，2]，从天然植物中提取杀虫活性物质防治农林害虫,已成为研究热点,并对现代农药研究具有重要意义。
       几丁质酶(chitinase)可以水解昆虫体壁和中肠中的几丁质，在昆虫变态发育过程中扮演重要角色。几丁质酶抑制剂通过抑制几丁质酶活性干扰昆虫正常变态发育过程而达到杀虫的目的。由于动植物机体不含几丁质，故以几丁质酶作为靶标的新型生物农药具有安全无害的优点[3，4]。目前已筛选出近十种不同来源的几丁质酶抑制剂, 包括糖类与肽类几丁质酶抑制剂[4]。而有关青蒿叶、桉树叶、红树植物白骨壤叶来源的几丁质酶抑制剂未见报道。
       大蜡螟(Galleria mellonella)属螟蛾科蜡螟亚科,是养蜂业的主要害虫。由于大蜡螟易于人工饲养，在农药学上可作为生测试虫[5]。本研究以大蜡螟为测试对象，研究青蒿叶、桉树、红树植物白骨壤叶乙醇提取物对它的毒杀作用以及对虫体几丁质酶活性的抑制作用，为开发新型安全植物源农药提供参考。
            1 材料
       大蜡螟虫(广西甘蔗研究所提供)。青蒿叶、桉树叶、红树植物白骨壤叶采自广西药用植物园、广西防城港等地。
       2 方法
       2.1 植物源农药提取物的制备称取10 g青蒿叶、桉树叶、红树植物白骨壤叶干燥粉末，加入20 ml 50%乙醇，超声萃取20 min，过滤，滤液减压蒸馏，收集膏状物并称重，用95%的乙醇溶解，配制成浓度为100 mg/ ml的植物提取物母液备用。
       2.2 杀虫实验选择虫龄与虫体大小基本一致的试虫20只，置于垫有中性滤纸的90 mm保湿玻璃培养皿中, 将植物提取物母液稀释为1.5%的浓度(内含1%的吐温80)，作为供试药液。采用小型喷雾器喷雾法对准虫喷雾,每皿喷药液约1 ml。对照组用95%的乙醇代替供试药液，将培养皿放置于26℃的人工气候培养箱培养24 h (昼夜比16∶8)。24 h后检查死虫数，计算死亡率与校正死亡率。死亡率(%)=(死亡的虫子/虫子总数)×100%，校正死亡率(%)=[(死亡率-对照组死亡率)/(1-对照组死亡率)]×100%。测定活虫体几丁质酶活力，计算酶活抑制率。每处理设3个重复。
       2.3 虫体蛋白质含量的测定 考马斯亮蓝G-250法测定大蜡螟虫匀浆液中蛋白质含量[6]。
       2.4 N-乙酰氨基葡萄糖还原糖的测定3，5-二硝基水杨酸(DNS)比色法测定[6]。
       2.5 几丁质酶液的提取与活性测定取1g虫体，冰浴研磨匀浆,制成10%匀浆液，离心(3 500 r/min) 20 min取上清用于酶活的测定。取0.5 ml上清液加入l ml磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(pH 6.6)，0.5 ml 1.5%胶体几丁质，于37℃水浴振荡酶反应30 min，立即沸水浴10 min终止酶反应后离心(4 000 r/min)5 min后取上清液0.5 ml，采用DNS法测定酶反应过程中产生的N-乙酰氨基葡萄糖还原糖的量。酶活力单位(U)以在上述反应条件下,每1 min产生1 μmol N-乙酰氨基葡萄糖还原糖所需的酶量计算。酶比活力以单位虫体蛋白质的酶活力表示。
       3 结果与分析
       3.1 植物源农药提取物的杀虫活性见表1。由表1可知，3种植物源农药提取物均表现出一定的杀虫活性。其中青蒿叶与桉树叶乙醇提取物对大蜡螟的校正死亡率较高，两者之间无显著性差异(P>0.05) 。校正死亡率最低的为红树植物白骨壤叶乙醇提取物，与青蒿叶、桉树叶乙醇提取物相比差异达到显著水平(P<0.05)。表1 植物源农药提取物的杀虫活性表中同列数据不同小写字母表示在P<0.05水平上有显著差异
       3.2 大蜡螟几丁质酶活性的测定根据牛血清白蛋白标准曲线(Y = 0.041 31X–0.033 56，R2 =0.999 2)求出大蜡螟虫匀浆液中蛋白质含量为33.7 ug/g鲜重。N-乙酰氨基葡萄糖标准曲线方程为Y = 1.264X- 0.019 3，R2 = 0.993 3，K=1.264。通过测定OD540并计算大蜡螟单位虫体蛋白的几丁质酶比活力。见表2。表2 大蜡螟几丁质酶活性测定
       几丁质酶在昆虫生长的每一阶段都必须维持在一定的水平,过量或缺乏都将对昆虫造成致命的影响。通过调节昆虫表皮和围食膜中几丁质酶的活性是很好的害虫防治策略。本研究中测得正常大蜡螟几丁质酶平均比活力为99.2 U/g蛋白。这一测定值代表了没有经过药液处理的大蜡螟虫体几丁质酶活总体水平。
       3.3 植物源农药提取物对大蜡螟几丁质酶活性的抑制由表3可知，3种植物源农药乙醇提取物对大蜡螟几丁质酶活力均表现出不同程度的抑制作用。其中青蒿叶与桉树叶乙醇提取物对大蜡螟几丁质酶活性抑制作用最强，两者之间无显著性差异(P>0.05)。而对几丁质酶活性抑制作用最弱的为红树植物白骨壤叶乙醇提取物，与青蒿叶、桉树叶乙醇提取物相比差异达到显著水平(P<0.05)。表3 不同植物提取物对大蜡螟几丁质酶的抑制作用表中同列数据不同小写字母表示在P<0.05水平上有显著差异
       以上3种植物源农药乙醇提取物对大蜡螟几丁质酶活力的抑制作用类型与机理以及对大蜡螟几丁质代谢系统的影响等方面还需深入研究。
       4 讨论
       青蒿别名黄花蒿、臭蒿, 一年生草本植物，为菊科篙属植物，研究报道证明青蒿除具有抗菌活性外,还具有杀虫活性。姚安庆等[7]研究了黄花篙的乙醇、氟仿、石油浸提物对菜粉蝶幼虫的拒食作用、触杀作用，结果表明黄花篙乙醇浸提物的活性较好，48h拒食率为72.11%。Maggi等[8]报道黄花篙地上部分的乙醇提取物对南部灰翅夜蛾的取食抑制率为87%。李云寿等[9]报道青蒿乙醇提取物对菜青虫5龄幼虫24h校正死亡率为63.33%。本研究中青蒿叶乙醇提取物对大蜡螟24h的校正死亡率为(69.0±3.87)%。说明青蒿叶乙醇提取物有较好的杀螟虫活性。桉树植物系属桃金娘科乔木，是广西引种最广泛的树种之一。有研究发现桉树叶的水提剂、乙醇提取物对钉螺具有较好的杀灭作用[10]。本研究中桉树叶乙醇提取物对大蜡螟24 h的校正死亡率为(53.47±11.63)%，具有较好的杀螟活性。红树植物是生长在热带和亚热带海岸潮间带的一种特殊的常绿植物群落，由于其所处的特殊生态环境，会产生许多其他陆生植物所不具备的特殊次生物质，邓业成等[11]报道采用叶片残毒法测定了16种红树植物甲醇提取物对柑橘红蜘蛛的杀螨活性，其中白骨壤枝叶甲醇提取物对柑橘红蜘蛛卵的校正死亡率达(83.29±2.73)%。而本研究中白骨壤叶乙醇提取物对螟虫的校正死亡率为(18.6±6.70)%，杀螟虫活性较低。这可能与所采用的溶剂不同、试虫不同等因素有关。
       青蒿叶、桉树叶、红树植物白骨壤叶3种植物源农药乙醇提取物对大蜡螟的杀虫活性与抑制几丁质酶活性相一致。说明几丁质酶可能是以上3种植物源农药的作用靶标酶。青蒿叶与桉树叶乙醇提取物具有较高的杀虫活性与抑制几丁质酶活性,可作为以几丁质酶为新靶点的生物农药。由于以几丁质酶作为靶标的新型生物农药具有对人、畜无害的优点，因此围绕几丁质酶设计开发新型农药品种,其运用前景极为广阔。而关于这几种植物杀虫活性成分的活性跟踪、提取、分离和筛选以及高活性的杀虫植物的直接利用方法,还有待于进一步的研究。
       【参考文献】
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