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       【摘要】 
       目的观察玻璃体腔注射蛇毒降纤酶和曲安奈德治疗外伤性玻璃体出血的效果，同时观察玻璃体腔细胞因子含量的变化。方法建立外伤性玻璃体出血动物模型。实验眼（右眼）随机分为生理盐水组、蛇毒降纤酶组、曲安奈德组、联合用药组。直接眼底镜观察玻璃体出血指数、增生性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy,PVR)程度；酶联免疫吸附法(enzyme-liked immunosorbent assay,ELISA)测定玻璃体液中细胞因子浓度。结果联合用药组玻璃体出血指数、PVR程度、玻璃体腔白介素-1β（Interleukin-1β，IL-1β）低于生理盐水组。玻璃体腔基质金属蛋白9、血小板源性生长因子、转化生长因子β1、表皮生长因子浓度与生理盐水组比较未见统计学意义。结论玻璃体腔注射蛇毒降纤酶和曲安奈德可以促进玻璃体腔出血的吸收及降低外伤性PVR程度；同时下调玻璃体腔IL-1β浓度。
       【关键词】  蛇毒降纤酶； 曲安奈德； 治疗； 外伤性玻璃体出血
       Combination Therapy for Traumatic Vitreous Hemorrhage in A Rabbit Model
       ZHAO Zhiyi, PENG Yanyi
       （Affiliated Hospital of Guilin Medical University, Guilin 510632,China）
       Abstract：ObjectiveTo study the therapeutic effect of intravitreal triamcinolone and defibrase injection for experimental traumatic vitreous hemorrhage and the variance of cytokines in vitreous.MethodsAll right eyes of 40 New Zealand albino rabbits were created as experimental rabbit model eyes of traumatic vitreous hemorrhage. The rabbits were divided into phosphate buffered saline group，triamcinolone group ，defibrase group and triamcinolone in combination with defibrase group randomly. The bleeding indexes in vitreous and degrees of proliferative vitreoretinopathy were estimated by direct ophthalmoscope examination. The contents of cytokines in vitreous were detected by enzyme-liked immunosorbent assay. ResultsThe bleeding indexes ，degrees of proliferative vitreoretinopathy,level of Interleukin-1β in vitreous in triamcinolone combination with defibrase group were lower than those of phosphate buffered saline group. ConclusionIntravitreal triamcinolone in combination with defibrase injection can promote the absorption of vitreous hemorrhage and decrease the degrees of proliferative vitreoretinopathy.
       Key words： Defibrase;   Triamcinolone ;  Therapia;   Traumatic vitreous hemorrhage
       
       临床上，伴玻璃体出血的眼球穿通伤PVR发生率远远高于视网膜脱离手术后PVR发生率［1，2］。目前治疗玻璃体出血的药物并不理想。蛇毒降纤酶是从一种纯化的凝血酶样酶制剂，它能水解纤维蛋白，促进出血的吸收［3，4］。曲安奈德是一种长效糖皮质激素，能够减轻炎症反应，抑制细胞的增生，有减轻PVR形成的作用［5，6］。本实验于2006-08～2008-10观察蛇毒降纤酶联合曲安奈德在外伤性玻璃体出血的治疗效果及玻璃体腔细胞因子的变化。
       1  材料与仪器
       1.1  动物健康新西兰大白兔40只，体质量2.25～2.5 kg，右眼为实验眼，左眼为空白对照眼。右眼随机分为生理盐水组（10眼）、蛇毒降纤酶组（10眼）、曲安奈德组（10眼）、联合用药组（10眼）。
       1.2  试剂和仪器蛇毒降纤酶5U/瓶（广西医科大学蛇毒研究所提供），每瓶曲安奈德40 mg/1 ml（昆明积大制药有限公司），IL-1β、基质金属蛋白9、血小板源性生长因子、转化生长因子β1、表皮生长因子酶联免疫吸附测定试剂盒由美国Bionewtrans Pharmaciutical公司提供。Clinibio128酶标检测仪，电子显微镜(日本HZTACHZ H-600型)。
       1.3  动物模型制作术前3 d点用洛美沙星滴眼液，复方托品酰胺散瞳，肌肉内注射氯胺酮35 mg/kg+氯丙嗪5 mg/kg，分离上方9～3点的球结膜，在角膜缘后2 mm处用巩膜穿刺刀刺向玻璃体中心部，用剪刀向两侧扩大切口，达8 mm，将脱出的玻璃体剪除，用8-0尼龙线间断缝合切口。以2 ml注射器抽取兔耳动脉血1ml，玻璃体腔注入0.3 ml全血。用1 ml注射器按实验各组要求把药物注入玻璃体：生理盐水组：注射生理盐水0.1 ml；蛇毒降纤酶组：注射蛇毒降纤酶0.1 U/0.1 ml；曲安奈德组：注射曲安奈德1.0  mg /0.1 ml；联合用药组：分别注射曲安奈德1.0 mg /0.1 ml及蛇毒降纤酶0.1 U/0.1 ml。
       2  方法
       2.1  玻璃体出血指数观察采用文献报道［7］分级方法。根据眼底四个象限可见程度分0～3级，各象限级别相加，总和即为指数。0级：积血完全吸收，眼底清晰；1级：玻璃体轻度积血，眼底轻度模糊，但尚能看清；2级：玻璃体中度积血，眼底很难看清，仅可见模糊结构；3级：玻璃体重度积血，眼底窥不进。手术后每两天使用直接眼底镜检查眼底情况，记录玻璃体出血指数。
       2.2  PVR分级观察采用Fastenberg分级方法［8］。手术后每两天使用直接眼底镜检查眼底情况，记录PVR程度。
       2.3  玻璃体液细胞因子浓度检测手术后7，14 d实验眼抽取0.1 ml玻璃体液，ELISA检测IL-1β、基质金属蛋白9、血小板源性生长因子、转化生长因子β1、表皮生长因子光度值。具体操作见试剂盒说明书。计算细胞因子浓度。
       2.4  视网膜毒性评价手术后28 d取离视盘下方2 mm处视网膜行常规HE染色、醋酸双氧铀与枸橼酸铅双重染色后行光学和电子显微镜检查。
       2.5  统计学分析采用SPSS10.0统计软件对数据进行处理。P<0.05表示差异有统计学意义。数据分析采用t-test、ANOVA及非参数检验Mann-Whitney Test法。
       3  结果
       3.1  玻璃体出血指数观察手术后3天联合用药组、蛇毒降纤酶组的眼底逐渐清晰，玻璃体尘状混浊，基本能看到视网膜情况；生理盐水组、曲安奈德组仍见玻璃体棕色混浊，眼底窥不清。结果见表1。表1  手术后3天玻璃体出血指数（略）
       3.2  PVR分级观察手术后28天联合用药组PVR程度低于生理盐水组，两组PVR程度比较：P=0.001 3＜0.01（Mann-Whitney test）。联合用药组PVR程度与蛇毒降纤酶组、曲安奈德组未见统计学意义，分别为P=0.435 9＞0.05；P=0.374 2＞0.05；（Mann-Whitney test）。结果见表2。表2  手术后28天PVR分级（略）
       3.3  玻璃体腔中IL-1β检测结果见表3。表3  玻璃体液IL-1β浓度的比较（略）
       各组间玻璃体液IL-1β含量比较 (a:P=0.008<0.05; b:P=0.018<0.05;Kruskal-wallis ANOVA)
       
       手术后7天联合用药组玻璃体液IL-1β浓度比生理盐水组、蛇毒降纤酶组低（分别为t 值：6.645、P 值=0.000 0<0.01；t"值4.494、P<0.05；t-test）；与曲安奈德组相比未见统计学意义（t 值：0.901、P值=0.379＞0.05；t-test）。
       
       手术后14天联合用药组玻璃体液IL-1β浓度比生理盐水组低（t" 值：9.259、P<0.05；t-test）；与曲安奈德组、蛇毒降纤酶组相比未见统计学意义（分别为t"值：1.794、P>0.05；t值0.577、P= 0.571>0.05；t-test）。
       3.4  手术后7、14天联合用药组玻璃体腔中基质金属蛋白9与生理盐水组比较未见统计学意义（分别为t"值1.615、P＞0.05；t值0.860、P=0.381＞0.05 t-test）；血小板源性生长因子与生理盐水组比较未见统计学意义（分别为t值0.653、P=0.451＞0.05；t值0.246、P=0.751＞0.05 t-test）；转化生长因子β1与生理盐水组比较未见统计学意义（分别为t值0.317、P=0.183＞0.05；t"值2.866、P＞0.05 t-test）；表皮生长因子浓度与生理盐水组比较未见统计学意义（分别为t值0.423、P=0.085＞0.05；t值0.752、P=0.967＞0.05 t-test）。
       
       3.5  视网膜毒性评价视网膜光镜检查见联合用药组视网膜各层结构整齐；电镜检查视网膜内外节排列整齐。
       4  讨论
          
       眼球穿通伤常伴玻璃体炎症、出血，外伤性PVR发生率则远远高于视网膜脱离手术后PVR发生率［1，2］。目前治疗玻璃体出血及PVR的药物不理想。本实验应用蛇毒降纤酶和曲安奈德治疗实验性外伤性玻璃体出血，观察其对玻璃体出血及PVR的治疗效果。蛇毒降纤酶是从蛇毒提取经生物技术纯化精制的一种强效凝血酶样酶,可直接作用于血浆纤维蛋白原的肽链A ,形成脱肽链A纤维蛋白可溶性单体而被溶纤酶迅速消溶;另外，蛇毒降纤酶还能激发血管内皮细胞产生组织溶纤酶原激活物( t-PA )促进出血的吸收［3，4］。本实验蛇毒降纤酶组及联合用药组玻璃体出血指数明显低于生理盐水组，说明玻璃体腔应用蛇毒降纤酶能有效地清除玻璃体的出血。曲安奈德是一种长效糖皮质激素，它有很强的抗炎作用，可降低炎症血管的渗透性、减少血-视网膜屏障的破坏。有学者报道［5，6］玻璃体腔应用曲安奈德可以减轻PVR形成的程度。本实验曲安奈德组及联合用药组PVR程度明显低于生理盐水组，说明玻璃体腔注射曲安奈德能够降低外伤性PVR程度。通过实验，我们观察到联合用药组能明显促进玻璃体腔出血的吸收及降低PVR的发展程度。
       
       在实验中，我们发现联合用药组玻璃体液IL-1β浓度比生理盐水组低。IL-1β是一种重要的炎源性细胞因子以及促纤维化因子。在玻璃体腔可由视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium;RPE)细胞、巨噬细胞分泌产生， IL-1β还可以刺激RPE细胞产生明胶酶，使之降解胶原和其它细胞外基质,在基质重建中及PVR形成中发挥作用［9～11］。联合用药组通过曲安奈德抗炎作用使到迁移至玻璃体腔的RPE细胞、巨噬细胞较生理盐水组减少；通过蛇毒降纤酶促进出血吸收的作用，减轻了玻璃体出血引起的以巨噬细胞为主的慢性玻璃体炎症。我们推测这可能是联合用药组玻璃体腔的IL-1β浓度较生理盐水低的原因，而玻璃体腔的IL-1β浓度的降低有助于降低PVR的发展程度。
       
       本实验联合用药组玻璃体腔基质金属蛋白9、血小板源性生长因子、转化生长因子β1、表皮生长因子浓度与生理盐水组比较未见统计学意义。提示联合用药的作用途径可能未涉及上述细胞因子。
       
       通过视网膜光镜、电镜检查未见联合用药对视网膜有毒性作用。综上所述，玻璃体腔曲安奈德和蛇毒降纤酶联合应用可以促进玻璃体腔出血的吸收；同时下调玻璃体腔IL-1β浓度，从而降低外伤性PVR程度。
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