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       【摘要】 
       目的探讨缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）在类风湿性关节炎组织中的表达情况。方法采用RT-PCR、免疫组化法检测大鼠类风湿性关节炎模型关节组织中HIF-1α蛋白的表达情况。结果HIF-1α蛋白在正常大鼠关节组织中不表达，但在RA模型中表达，且表达随模型时间的延长而增加。结论HIF-1α在类风湿性关节炎组织中表达, 并与炎症严重程度呈正相关，提示HIF-1α对风湿性关节炎的发生发展起重要作用。
       【关键词】  缺氧诱导因子-1α； 类风湿性关节炎； RT-PCR； 免疫组化
       Expression of Hypoxia - inducible Factor 1 alpha ( HIF - 1α) in RA Mice
       LUO Naixiang, CHEN Senzhou, WANG Xianfeng, HOU Qiaoyan
       （Guilin Medical University, Guilin 541004，China）
       Abstract：ObjectiveTo investigate the expression of hypoxia - inducible 1 alpha (HIF - 1α) in RA mice. Methods Imunohistochemistry and RT-PCR were used to detect the expression of HIF - 1α in the joint tissues of RA mice. ResultsThe joint tissues of mice showed no detectable HIF - 1α. In contrast, increased level of HIF - 1α was found in RA mice.The upregulated expression of HIF - 1α in RA mice models had close relationship with RA severely. ConclusionHIF - 1α plays an important role in the occurrence and progression of RA.
       Key words： Hypoxia - inducible factor 1alpha (HIF - 1α);   Rheumatoid arthritis（RA）;   RT-PCR;   Immunohistochemistry
       
       HIF-1(hypoxia inducible factor-1)是一种调节细胞氧平衡和缺氧反应基因表达的核转录因子, 是在缺氧诱导的细胞核提取物中发现的, 调节细胞适应低氧状态下的能量代谢和氧的运输, 是体内维持细胞内氧平衡的主要调控因子［1］。在缺氧条件下，HIF-1蛋白及其靶基因表达增加。类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)是一种原因未明且多发的全身自身免疫性疾病，其关节腔为缺氧微环境，基本病理改变主要是滑膜慢性炎症及关节软骨和骨质的破坏，临床特征为关节结构的炎症和肿胀、慢性进行性病程，并可致多个关节完全强直，最终导致功能的丧失。有关RA组织中HIF-1α的表达及作用, 目前国内少见报道。我们采用RT-PCR及免疫组化方法检测正常大鼠、RA模型大鼠中HIF-1α的表达情况, 旨在探讨HIF-1α在RA发生发展中的作用。
       1  材料
       1.1  动物模型制作30只体质量为180～200g 成年Wistar大鼠（雌雄不拘），24只参照熊国林等［2］制作大鼠类风湿性关节炎模型的方法造模，6只正常饲养。
       1.2  组织准备24只模型动物分期分批，每批4只分两组分别用1%戊巴比妥钠(50 mg/ kg)作腹腔注射。深麻醉下，一组快速开胸经左心室插管至升主动脉快速灌注70～90 ml生理盐水，再以0.1 mol/ L磷酸缓冲液(PB，pH 7.6，由NaH2PO4和Na2HPO4各适量加双蒸水配置而成) 配制的4%多聚甲醛400 ml灌注固定，灌注固定后立即取膝关节周围软组织，置4%多聚甲醛中后固定2h，之后脱水、石蜡包埋，恒冷切片机切片, 片厚4 μm, 切片裱贴于赖氨酸涂布的玻片上，用于HE染色和免疫组化染色。另一组在深麻醉下取关节组织用于RNA的提取。6只正常大鼠分两组按上述方法分别取组织用于HE染色、免疫组化染色及总RNA提取。
       2  方法
       2.1  RT-PCR取下的关节组织用TRIZOL试剂按试剂盒说明书提取组织总RNA。按我们原先设计的引物及反应条件获得产物，产物经1.8%琼脂糖凝胶电泳［3］。
       2.2  HE染色
       切片经二甲苯脱蜡、水化后，滴加苏木精染液20min，蒸馏水返蓝5min，盐酸酒精分色，蒸馏水冲洗，伊红染液复染，蒸馏水冲洗，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。用装有数码照相机的显微镜观察并拍照。
       2.3  免疫组化染色 
       所有切片经脱蜡、水化后，为更好暴露核抗原，将切片用EDTA（pH9.0，迈新公司产品）做热修复20 min。为消除内源性过氧化物酶活性，将切片用3%H2O2室温孵育20min后，用0.01 mol/L的PBS缓冲液（pH 7.4）冲洗3次共10 min。滤纸吸干后加入浓缩型鼠抗HIF-1α单克隆抗体（Newmaker，1∶50稀释）中4℃孵育过夜， 0.01 mol/L的PBS缓冲液（pH 7.4）冲洗10 min，加50 μl MaxvisionTM即用型二抗（迈新产品）中室温孵育15 min后，0.01 mol/L的PBS缓冲液（pH 7.4）冲洗10 min，最后, 在DAB显色液（迈新产品）中反应5 min，蒸馏水冲洗，苏木精复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，用装有数码照相机的显微镜观察并拍照。用PBS代替一抗做阴性对照，阳性对照片用已知人宫颈鳞癌阳性片（本院病理科切片）。HIF-1α以细胞核或胞质内有棕黄色细颗粒为阳性。将照片在Adobe Photoshop 中作图像处理。选出样片，组版，打印。
       2.4  统计学处理应用SPSS 10. 0 统计软件对数据进行统计学处理，样本率的比较采用χ2 检验；参数间的相关性采用kappa 值检验。
       3  结果
       3.1  HE染色 
       肉眼可见大鼠RA模型关节局部组织充血。镜下可见关节腔滑膜增生、炎症、细胞增殖、肉芽肿形成，软骨及骨组织破坏（图1A）。
       3.2  免疫组化染色观察 
       HIF-1α蛋白的表达: 正常大鼠关节组织中检测不到HIF-1α免疫阳性细胞，而模型组HIF-1α阳性反应物为棕黄色颗粒, 主要位于关节细胞的胞核及胞浆中，并且HIF-1α的表达随着模型时间的延长而增多（图1B）。正常组与实验组结果之间有统计学差异( P＜0.05）。
       3.3  RT-PCR结果观察　
       RT-PCR结果经1.8%琼脂糖凝胶电泳后获得一条约2.5 kb的清晰条带(图2)。
       4  讨论
          
       HIF-1是调节机体内细胞对缺氧反应的核转录因子,其表达受氧浓度调节。HIF-1β呈固定表达，HIF-1 的活性主要由HIF-1α决定。通常HIF-1α只能在低氧情况下稳定表达,氧浓度< 6 %时，HIF-1α含量呈指数级上升，氧浓度< 0. 5 %(相当于氧分压1.33～2.00 kPa) 时其含量达最高峰。细胞缺氧时，HIF-1α稳定表达并从胞浆转移至胞核，同时HIF-1β从胞浆转移到核，两者聚合成HIF-1分子而发挥核转录因子的作用。在多种病理状态中，HIF-1α的表达异常。
       4.1  RA关节腔为缺氧微环境，滑膜中表达HIF-1α佐剂诱导的大鼠关节炎模型(AA)［4］ 主要表现为多发性关节炎，比较接近人体RA。RA病变关节腔的滑膜细胞大量增加，滑液量增多，压迫滑膜毛细血管致其血流减慢，导致RA关节腔为缺氧环境，滑膜中表达HIF-1α。早在1970 年，Lund-Olesen 报道RA患者的关节腔为缺氧环境，氧分压(PO2)为3.60kPa，骨关节炎(OA)患者中为5.73kPa ，正常对照组为8.40kPa。进一步研究发现RA患者中PO2和疾病严重程度(病理学评分)负相关。最近研究表明［5］ ，HIF-1α的水平的调节不仅仅由氧浓度调节，多种细胞因子和生长因子已被证实在正常氧浓度下使HIF-1蛋白的稳定性增加及其靶基因的表达增加。Gatromanolaki［6］ 等则报道HIF-1α在RA和OA滑膜中的表达均升高，且主要在成纤维细胞表达，巨噬细胞、淋巴细胞和内皮细胞中也有部分表达。本实验结果显示在正常大鼠关节滑膜中没有或检测不到HIF-1α，而模型大鼠则有表达，并随模型时间的推移而表达增加，说明模型时间越长，关节腔缺氧越严重。
       4.2  HIF-1α在RA的发病机制中可能参与调控糖酵解代谢启动并持续髓细胞介导的炎症反应髓细胞是免疫系统的重要组成部分，包括粒细胞、单核-巨噬细胞，在RA的整个病理过程中占重要地位。无论在缺氧还是有氧情况下，髓细胞均依赖糖酵解产生ATP供能，这与髓细胞中线粒体含量甚少有关。糖酵解过程的抑制剂可抑制髓细胞的上述作用，而线粒体呼吸链抑制剂则无此作用。HIF-1α通过调控糖酵解通路影响髓细胞功能。HIF-1α表达增加使糖酵解作用增强，髓细胞能量供给充足，从而发挥聚集、粘附、游走、浸润、吞噬等作用启动炎症反应并使之持续。Cramer等［7］在体外试验中发现在HIF-1α基因缺失的髓细胞，无论在缺氧环境还是正常氧浓度下，其ATP和乳酸的含量均明显降低，而乳酸含量是髓细胞活化发挥炎症作用的标志之一。体内试验进一步证明在髓细胞HIF-1α基因缺失的急性或慢性炎症小鼠模型中，HIF-1α基因缺失组较野生型组疾病严重程度降低。
       
       HIF-1α在RA发病机制中作用的深入研究将有助于进一步阐明RA的本质,并为RA的基因治疗领域开辟新途径。国外有学者［8］设想和尝试在治疗基因的启动子中插入HRE的基因序列后转染巨噬细胞，将转染后的巨噬细胞注入局部关节腔内，使治疗基因的表达在HIF-1α的调控之下通过巨噬细胞作用于其它病变关节，从而提高基因治疗的靶向性与效率。以HIF-1为靶点的基因治疗方法将会成为RA等许多疾病治疗研究的新方向。
       【参考文献】
         　［1］Semenza GL. HIF-1: mediator of physiological and pathophysiological responses to hypoxia ［J］. J Appl Physiol, 2000, 88:1474 .
       
       ［2］熊国林，黄海潇，谢玲，等.类风湿性关节炎大鼠模型的制备［J］.解放军医学杂志，2007，32（2）：121.
       
       ［3］ 陈森洲，王险峰，骆耐香.低氧诱导因子-1α的基因克隆［J］.右江医学，2007，35（5）：498.
       
       ［4］王金荣，王宏伟，韩秀珍,等.静脉注射丙种球蛋白对佐剂关节炎的作用［J］.基础医学与临床,2004,24(6):669.
       
       ［5］Taylor PC, Sivakumar B. Hypoxia and angiogenesis in rheumatoid arthritis［J］. Curr Opin Rheumatol, 2005,17(3):293.
       
       ［6］Gatromanolaki A,Sivridis E,Maltezos E,et al.Upregulated hypoxia inducible factor-1α and HIF-2α pathway in rheumatoid arthritis and osteoarthritis［J］.Arthritis Res Ther,2003,5(4):R193.
       
       ［7］Cramer T, Yamanishi Y,Clausen BE ,et al. HIF-1alpha is essential for myeloid cell-mediated inflammation［J］. Cell, 2003,112(5): 645.
       
       ［8］Hollander AP ,Corke KP , Freemont AJ ,et al. Expression of hypoxia-inducible factor 1alpha by macrophages in the rheumatoid synovium: implications for targeting of therapeutic genes to the inflamed joint ［J］. Arthritis Rheum, 2001,44(7):1540.