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       【摘要】 
       目的选择黄连解毒汤方药的提取工艺。方法以小檗碱、黄芩素、栀子苷、总生物碱、总黄酮、1000D提取物为指标，采用半仿生提取法(SBE法)、醇提取法（AE法）、水提取法（WE法）进行比较研究。结果6个指标综合评价Y值为：SBE液>AE法>WE液。结论黄连解毒汤以采用SBE法提取为佳。
       【关键词】  黄连解毒汤； 指标成分； 超滤； 提取方法
       Comparison of 3 Kinds of Extract Solutions for Preparation of Huanglian Jiedu Decoction
       DOU Jinming, SUN Xiumei*, ZHANG Zhaowang, JING Hanwei
       (Shandong University of TCM, Jinan,250355, China)
       Abstract：ObjectiveTo optimize the extraction technology of Huanglian Jiedu Decoction.MethodsTaking the berberine, baicalin, geniposide, total alkaloid, total flavonoid, extract of molecular 1000D as the indexes, the methods of semi-bionics extraction(SBE), alcohol extraction（AE），water extraction（WE）were compared.ResultsThe total index Y value of the six indexes was:SBE>AE>WE.ConclusionThe SBE is the best extraction method in preparation of Huanglian Jiedu Decoction.
       Key words：Huanglian Jiedu Decoction;  Marker components;  Ultrafiltration;  Extraction methods
       
       黄连解毒汤始见于唐·《外台秘要》，由黄连、黄芩、黄柏和栀子组成，具有清热、泻火、解毒之功效。根据SBE法理论［1，2］，在SBE法工艺优选和醇提最佳浓度的基础上，为进一步探讨该方药用SBE法提取是否较目前普遍使用的提取方法为佳，故以小檗碱、黄芩素、栀子苷、总生物碱、总黄酮、1000D提取物为指标，对该方药3种提取方法进行平行对照实验。
       1  仪器与药品
          
       pHS-3C型精密pH计（上海雷磁仪器厂）；MA110型电子分析天平（上海第二分析仪器厂）；AgiLent1100高效液相色谱仪（G1315A二极管阵列检测器）；UV3010型紫外分析仪（日立公司）；KQ-250E型医用超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；中空纤维超滤膜（上海德宏生物医学科学科技发展有限公司）。
       
       中药经山东中医药大学张兆旺教授鉴定：黄连为毛茛科植物黄连Coptis chinensis Franch 的干燥根茎；黄芩为唇形科植物黄芩 Scμtellaria baicaLensis Georgi 的干燥根；关黄柏为芸香科植物黄檗Phellodendron  amμrense  Rupr的干燥树皮；栀子为茜草科植物栀子Gardenia jasminoides Ellis的干燥成熟果实。
       
       盐酸小檗碱（111595－200604）、黄芩素（110715－200815）、栀子苷（110749－200613）均购自中国药品生物制品鉴定所；甲醇、乙腈均为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。
       2  方法
       2.1  样品液制备
       2.1.1  半仿生提取液（SBE液）按处方比例称取10～20目黄连15 g、黄芩10 g、关黄柏10 g、栀子15 g，按黄连、栀子合煎，黄芩、关黄柏合煎的组合方式，分别浸泡30 min，分别用SBE法提取3次，加水量依次为药量的10,8，8倍，3煎pH值依次为6.0，7.5，8.5，提取时间依次为120，60，30 min，分别将3煎提取液依次粗滤，离心，一定规格的中空纤维超滤膜滤过，浓缩，合并，定容至250 ml，即得方药1 000 D提取物的SBE样品液 (质量浓度为2.0×102 g·L-1)。
       2.1.2  醇提液（AE液）按“2.1.1”项下方法，只改用优选的醇提最佳浓度61%的醇溶液作溶剂，依法即得方药1000D提取物的AE样品液(质量浓度为2.0×102g·L-1)。
       2.1.3  水提液（WE液）按“2.1.1”项下方法，只改用水作溶剂，依法即得方药1000D提取物的WE样品液(质量浓度为2.0×102g·L-1)。
       2.2  供试液的制备精密量取“2.1”项下SBE、AE、WE样品液各10.0 ml，水浴浓缩蒸至近干，加硅藻土0.8 g，蒸干，研匀，精密加入甲醇25 ml溶解，称重，超声提取30 min，放冷，补足失重，滤除残存硅藻土，即得SBE 、AE、WE供试液A（质量浓度80 g·L-1）。供测定总生物碱。
       
       精密量取上述供试液A各2.5 ml，用甲醇定容至10ml，即得SBE，AE，WE供试液B（质量浓度20 g·L-1）。供测定小檗碱、栀子苷。
        精密量取“2.1”项下SBE 、AE、WE样品液各10.0 ml，拌入聚酰胺60～90目0.5 g，加入已处理的聚酰胺柱上。依次以蒸馏水300 ml,20%乙醇100 ml,70%乙醇80 ml洗脱至无色，收集洗脱液，浓缩，再用70%乙醇定容至50 ml，得溶液甲。精密量取上述溶液甲各25.0 ml，水浴蒸干，残渣加甲醇定容至10ml，即得SBE 、AE、WE供试液C (1.0×102g·L-1) ，供黄芩素含量测定。
       
       精密吸取上述溶液甲各0.35 ml，用70%乙醇定容至10 ml，得SBE 、AE、WE供试液D (质量浓度为1.4×g·L-1)，供总黄酮含量测定。
       2.3  对照品溶液的制备精密称取盐酸小檗碱对照品9.88，5.05 mg，分别依次用甲醇和pH 7.0的缓冲溶液配制，得对照液Ⅰ（0.395 mg·ml-1）和对照液Ⅱ（0.101 mg·ml-1）。
       
       精密称取黄芩素对照品7.38，3.68mg，分别依次用甲醇和70%乙醇配制成对照液Ⅲ（0.295mg·ml-1）和对照液Ⅳ（0.147mg·ml-1）。
       
       精密称取栀子苷对照品7.33mg，用甲醇配制成对照液Ⅴ（0.293 mg·ml-1）。
       2.4  小檗碱含量测定
       2.4.1  色谱条件色谱柱为Diamonsil C18 （5  μm，250 mm×4.6 mm）；流动相为乙腈-0.05mol/L KH2PO4（30∶70）；检测波长265 nm；流速1.0 ml/min；进样量20μl；柱温30℃。［3］。见图1。
       2.4.2  标准曲线的绘制精密吸取“2.3”项下对照液Ⅰ，按上述色谱条件，进样2，4，6，8，10 μl。以峰面积为纵坐标，盐酸小檗碱的含量（μg）为横坐标，得回归方程为：Y =1 662.9X+127.44  r= 0.999 6(n=5)，线性范围0.79～3.95 μg。
       2.4.3  含量测定按上述方法，将SBE，AE，WE供试液B经0.45 μm微孔滤膜滤过，进样20μl，分别平行进样3次，测得峰面积，计算含量。结果见表1。
       2.5  总生物碱含量测定
       2.5.1  标准曲线的绘制精密吸取“2.3”项下对照液Ⅱ0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 ml，用pH 7.0的缓冲液稀释至2.0 ml。加入0.007%溴麝香草酚蓝8.0 ml，摇匀，加入氯仿10.0 ml，振摇，静置分层2 min。分取氯仿层，用干燥滤纸滤过，相应试剂为空白，在413 nm测定，以浓度为横坐标，吸收度为纵坐标，回归方程：Y=59.802X-0.009 4，r=0.999 5（n=5），线性范围为4.04～12.12 μg·ml-1［4］。
       2.5.2  含量测定
       精密吸取SBE、AE、WE供试液A各0.15 ml，按上述方法，依次加入氯仿10.0，10.0，5.0 ml萃取，依法测定，总生物碱含量以盐酸小檗碱计算。结果见表1。表1  黄连解毒汤3种不同提取液各指标成分含量及标准化处理结果（略）
       2.6  黄芩素含量测定
       2.6.1  色谱条件色谱柱为Diamonsil C18 （5 μm，250 mm×4.6 mm）；流动相为甲醇-0.4%醋酸水（70∶30）；检测波长275 nm；流速1.0 ml·min-1；进样量20 μl；柱温30℃［5］。结果见图2。
       2.6.2  标准曲线精密吸取“2.3”项下对照液Ⅲ1，2，3，4，5 μl，按上述色谱条件测定。以峰面积为纵坐标，黄芩素的含量（μg）为横坐标，回归方程为：Y= 4 129.4X–241.09  r=0.999 5(n=5)，线性范围0.295～1.475 μg。
       2.6.3  含量测定精密吸取SBE、AE、WE供试液C，各进样20 μl，按上述色谱条件，依法测定计算黄芩素的含量。结果见表1。
       2.7  总黄酮含量测定
       2.7.1  标准曲线的绘制精密吸取“2.3”项下对照液Ⅳ0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 ml，用70%乙醇稀释至10 ml。以70%乙醇为空白，在278 nm处测定，浓度为横坐标，吸收度为纵坐标，回归方程为: Y=101.22X+0.024 4  r=0.999 4(n=5)，线性范围：1.47～7. 35μg·ml-1［6］。
       2.7.2  含量测定按上述方法测定SBE、AE、WE供试液D，总黄酮含量以黄芩素计算。结果见表1。
       2.8  栀子苷含量测定
       2.8.1  检测条件色谱柱：DiamonsiL（TM）钻石C18 （5 μm，250 mm×4.6 mm）；流动相：乙腈-水（15∶85）；检测波长：238 nm；流速：1.0 ml/min；进样量：20 μl；柱温：30℃［7］。结果见图3。
       2.8.2  标准曲线的绘制精密吸取“2.3”项下对照液Ⅴ 1，5，10，15，20 μl，按上述色谱条件测定。以峰面积为纵坐标，栀子苷含量（μg）为横坐标，回归方程为：Y=1 511.8X-42.55  r= 0.999 8(n=5)，线性范围0.293～5.86 μg。
       2.8.3  含量测定精密吸取SBE、AE、WE供试液B，各进样20 μl，按上述色谱条件，依法测定计算栀子苷的含量。结果见表1。
       2.9  1000D提取物测定精密吸取SBE、AE、WE样品液各10.0 ml，分别置干燥至恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，105℃烘至恒重，计算1000D提取物得率。结果见表1。
       2.10  实验结果和数据综合评判方法将小檗碱、黄芩素、栀子苷、总生物碱、总黄酮、1000D提取物等6项指标汇总，按下列公式进行标准化处理x "i.j=(xi,j-j)/sj。式中x "i.j为标准化后的值，xi.j为样品液i中成分j的含量，j为各种样品液i中成分j的平均值，为成分j的标准偏差。根据各指标在工艺选择中的主次，给予不同的加权系数，即得综合评价指标Y值，Y=［(小檗碱+黄芩素+栀子苷)÷3］×5+［(总生物碱+总黄酮)÷2］×3+ 1000D提取物×2。Y值大者为佳。结果SBE Y值最大，结果见表1。
       3  讨论
          
       3种提取液小檗碱、黄芩素、栀子苷、总生物碱、总黄酮、1000D提取物得率等6项指标综合评判Y值的大小顺序为：SBE液>AE法>WE液，提示本制剂的方药提取用SBE法为佳。
       
       本研究是对提取纯化的最终产物“1000D提取物”，作小檗碱、黄芩素、栀子苷、总生物碱、总黄酮的测定，即使对单体成分一无所知的中药及其复方，也可以用1000D的提取物量为指标，选择提取工艺和控制质量，这符合中医药的整体观，对中药现代化研究是很有借鉴意义的。
       
       以小檗碱、黄芩素、栀子苷这3个已知有效成分为指标，同时以总生物碱、总黄酮、1000D提取物为指标，综合评价选择提取工艺。这样做体现了方剂药效物质提取中，坚持“有成分论，不唯成分论”，发挥活性混合物综合作用特点的SBE法观点。同时也有利于用单体成分控制制剂的质量。
       【参考文献】
         　［1］张瑞亭,张兆旺,孙秀梅.思维方式的转换与中药“半仿生提取法”［J］.中国中药杂志，1997,22(9):542.
       
       ［2］张兆旺,孙秀梅.中药方剂药效物质提取新技术——对“半仿生提取模式”的探讨［J］.世界科学技术—中药现代化,2000,2(4):53.
       
       ［3］王晓林，钟方丽.HPLC测定复肾宁片中盐酸小檗碱的含量［J］.中成药,2008,30(3):463.
       
       ［4］张学兰,张兆旺，徐霞，等.黄柏SBE法与WE法的成分比较［J］.中国中药杂志,1999,20(20):600.
       
       ［5］范全民，孙冬云，周慧娟，等.HPLC测定黄连上清片中黄芩苷的含量［J］.中药材,2006,28(10):1545.
       
       ［6］李云鹏，黄芸，魏春娥，等.紫外光度法测定黄芩中总黄酮含量［J］.河北中医药学报，2007,22(1):36.
       
       ［7］雷鹏，刘韶，李新中，等.对《中国药典》2005年版Ⅰ部栀子药材栀子苷含量测定方法的探讨［J］.中药新药与临床药理，2007,18(3):225.