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       【摘要】 
       目的观察脑通复方制剂对拟血管性痴呆(VaD)模型大鼠脑组织神经型尼古丁受体（Nicotinic acetylcholine receptors ，nAChR）的影响，分析脑通复方制剂改善血管性痴呆学习记忆能力的作用机制。方法采用改良Pulsinelli四血管阻断（Pulsinelli"s four-vessel occlusion, 4-VO）法复制大鼠血管性痴呆模型，脑通复方制剂治疗后观察学习记忆能力，Western-blot法测定脑组织神经型尼古丁受体蛋白水平。结果脑通复方制剂可缩短实验大鼠逃避潜伏期，增加跨越平台次数，上调海马组织神经型尼古丁受体的表达。结论脑通复方制剂可通过上调nAChR表达，从而改善血管性痴呆学习记忆能力。
       【关键词】  脑通复方制剂； 血管性痴呆； 学习记忆； 神经型尼古丁受体
       Effect of Nao Tong Compound Recipe on the Expression of Nicotinic Acetylcholine Receptors of Hippocampal in Vascular Dementia Rats
       XIAO Yan, WANG Xiaoliang, DENG Jie,YAN Xiuming,HUANG Yong，KUANG Shixiang,GUAN Zhizhong
       The Key Lab of Medical Molecular Biology, Guiyang Medical College，Guiyang 550004，Guizhou，China
       Abstract：ObjectiveTo observe the influnce of Nao Tong Compound Recipe on the nicotinic acetylcholine receptors (nAChR) in rats with vascular dementia(VaD) and to explore the preventive effects of traditional Chinese medicine on spatial learning and memory deficits in rats with VaD. MethodsVaD model was created with the reformed Pulsinelli 4－VO method. After establishing the model, the rats were treated with Nao Tong compound recipe. The ability of learning and memory of VaD rats were assessed by Morris Water Maze Test．The expression of Nicotinic acetylcholine receptors in hippocampus was detected by Western-blot method. ResultsThe ability of learning and memory of VaD rats was improved and the expression of nAChR in hippocampus was increased after treatment with Nao Tong compound recipe. ConclusionBy increasing the expression of nAChR and protecting neurons in hippocampus following ischemia,Nao Tong compound recipe may improve the ability of learning and memory of VaD rats．
       Key words： Nao Tong Compound Recipe；  Vascular Dementia；  Learning and memory；  Nicotinic acetylcholine receptors
        血管性痴呆(vascular dementia，VaD)是因血管疾病所致的智能及认知功能障碍的临床综合征，是老年性痴呆中最常见的类型之一， 目前尚无有效的治疗方法。但VaD是一种可以预防的痴呆,早期治疗具有可逆性。因此，探索VaD发病的相关因素、早期诊断方法及其防治措施，是医学基础研究和临床研究的主要课题。神经型尼古丁乙酰胆碱受体(Nicotinic Acetylcholine Receptors, nAChR) 在大脑的学习、记忆、注意力的保持等方面起着重要作用［1, 2］。脑通复方制剂由人参、黄芪、蔓荆子、白芍、葛根、黄柏、升麻、甘草等为基础，并配以水蛭、天麻等化淤、通络、健脑之品组方。为探讨脑通复方制剂对VaD的预防效果和可能的机制，采用四血管阻断法制作VaD模型［3, 4］，用脑通复方制剂预防性治疗，用Morris水迷宫检测学习记忆能力。结果发现脑通复方制剂对血管性痴呆大鼠空间学习记忆减退有明显防治作用，并从神经型胆碱能受体方面初步探讨防治作用的机制，为脑通复方制剂临床防治VaD提供实验室依据。
       1  材料与仪器
       1.1  动物健康清洁级Sprague-Dawley（SD）大鼠60只，雌雄各半，6～8月龄，体质量300～350 g，均由贵阳医学院动物研究中心提供［合格证号: SCXK(黔) 200220001］。随机分组分笼饲养，室内常温下配方饲料喂养，自由饮食水。适应环境1周后进行实验。
       1.2  药物脑通复方制剂由益气聪明汤化裁而成，主要药物有西洋参、天麻、黄芪、水蛭等，由贵阳医学院药学系按一定比例研制成浸膏，临床人日用生药量为23.5 g。对照用药安力申每片5 mg，成人用药量5 mg/d，批号：070308A。以上药品实验前用双蒸水配制成所需浓度的混悬液，4℃冰箱保存，皆灌胃给药。
       1.3  仪器及试剂Morris水迷宫（DNS-2型），由中国医学科学院药物研究所提供。羊抗α4、α7，兔抗α3多克隆抗体及HRP标记的抗羊、抗兔及抗鼠二抗购自美国Santa Cruz Biotechnology Inc公司；鼠抗β-肌动蛋白单克隆抗体购自美国Sigma公司；聚乙烯二氟（Polyvingliene fluoride , PVDF）膜、ECL-Plus发光试剂、高效显影胶片购自Amersham公司。
       2  方法
       2.1  动物筛选与分组大鼠适应性喂养1周后，先进行Morris水迷宫训练。第1～4天行定向航行实验，每天将大鼠按Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ象限的顺序单独放入水中，站台置于第Ⅰ象限，记录60 s内大鼠从水中爬上站台所需时间为逃避潜伏期；第5天行空间探索实验，记录2 min内大鼠在第Ⅰ象限游泳时间和穿越站台次数。选取学习能力、记忆力相近的大鼠，淘汰4只大鼠。将余下大鼠56随机分出12只作为假手术组，其余44只采用改良Pulsinelli四血管阻断(4－VO)法制造血管性痴呆大鼠模型。
       2.2  VaD 模型的复制大鼠于术前禁食12 h，不禁水。用10%水合氯醛(300 mg·kg-1体质量)腹腔麻醉大鼠, 将大鼠俯卧固定，行背侧颈正中切口,逐层钝性分离，暴露双侧第一颈椎横突翼小孔,用直径0.5 mm的电凝针插入双侧翼小孔烧灼双侧椎动脉,造成永久性闭塞。然后，再将大鼠仰卧固定，行腹侧颈正中切口,钝性分离双侧颈总动脉,以“4”号丝线穿线备用。24 h后，用微动脉夹可逆性夹闭双侧颈总动脉5 min,共夹闭3次,每次间隔1 h。局部伤口缝合前，以青霉素局部喷洒处理防止感染，术后3 d给予青霉素20万U·只-1肌肉注射抗感染,常规饲养、观察。假手术组手术程序同上，仅暴露4条血管, 但不进行椎动脉烧灼和颈总动脉夹闭。
       2.3  动物分组4-VO术后死亡和淘汰共8只，实际成模为36只，根据随机数字表随机分为3组：模型组12只，脑通复方制剂组12只，安力申组12只。假手术组和模型组均灌服等量生理盐水；防治组给予脑通复方制剂8 g·kg-1·d-1，用双蒸水配制浓度为0.55 g生药/ml的混悬液；西药对照组给予安力申0.625 mg·kg-1·d-1，用蒸馏水配制为0.1 mg/ml的混悬液；各组均每天分两次灌胃给药，灌胃体积为1.0 ml·100 g-1，连续灌药1月。
       2.4  学习记忆能力测试于大鼠手术及造模后第5周再次进行Morris水迷宫检测，检测方法同前。
       2.5  nAChR  α3， α4， α7亚单位蛋白水平取海马组织，在玻璃匀浆器中，加入冰预冷的5 ml Buffer A（50 mmol/L Tris,50 mmol/L NaCl,2 mmol/L EDTA,pH 7.40，10% trixton-100）及PMSF和复合蛋白酶抑制剂，于冰上制成脑组织匀浆，并置于冰上1 h，使脑组织细胞充分溶解，用含有蛋白酶抑制剂的50 mmol/L PBS (pH=7.4)制备细胞匀浆，12 000 r/min 4℃,离心40 min，小心吸取上清液至EPP管，用考马斯亮蓝法对上清液进行蛋白定量。取10%海马组织匀浆进行Western-blotting检测nAChR的 α3， α4， α7亚单位及β-actin蛋白表达。
       2.6  结果分析Western blotting结果用GDS-8000型UVP凝胶成像系统照像，以Labworks软件分析结果时以β-actin蛋白条带作为内参照，计算nAChR的 α3， α4， α7亚单位蛋白条带与β-actin蛋白条带像素灰度的百分比值作为nAChR的 α3， α4， α7亚单位蛋白质表达的相对水平。
       2.7  统计学分析方法数据用±s来表示,用单因素方差分析进行检验，α= 0.05为差异有统计学意义,数据统计由SPSS12.0软件包完成。
       3  结果
       3.1  学习记忆能力模型组大鼠平均逃避潜伏期明显长于假手术组(P<0.01)，表明VaD大鼠学习能力降低；脑通复方制剂组及安力申组大鼠第1～4天平均逃避潜伏期与模型组比较明显缩短(P<0.01)，见表1；撤去平台后,以在原平台象限(第I象限)的活动时间为指标,与假手术组、脑通复方制剂组、安力申组比较，模型组第1次穿越平台所用时间延长（P＜0.01或P＜0.05）,穿越站台次数明显减少(P＜0.05) 。见表2。表明脑通复方制剂治疗后，VaD大鼠的学习能力改善。
       3.2   nAChR α3， α4， α7亚单位蛋白水平模型组nAChR α3， α4， α7亚单位蛋白水平较假手术组降低（P<0.01），脑通复方制剂和安力申可提高模型鼠nAChR α3， α4， α7亚单位蛋白水平（P＜0.01或P＜0.05）。见图1。表1  各组大鼠定向航行实验中每日平均逃避潜伏期（略）表2  各实验组空间探索实验中第1次穿越平台时间和穿越平台次数（略）
       4  讨论
         VaD病因病机复杂，各家认识有所不同，但一般研究认为本病病位在脑，涉及心肝脾肾，病性为本虚标实，虚有肾虚、气虚、实有风、火、痰、瘀，二者互为因果，治疗时应标本兼治，以补虚不忘调气化痰活血，祛邪不忘益精养血补气为原则。脑通复方制剂由益气聪明汤化裁而成，主要由西洋参、天麻、黄芪、水蛭等药物组成，虚实并治，平衡阴阳，具有益气升阳，通络健脑之功效。脑通复方制剂灌胃VaD大鼠后，逃避潜伏期缩短，第I象限活动时间和穿越平台次数增加，学习记忆能力明显改善。人和动物脑的学习记忆功能涉及的机制十分复杂，且未完全阐明，学习和记忆功能与多个脑区的神经元及神经元之间的联系、多种神经递质或介质都有关系。在腑缺血时，引起神经元缺氧导致其功能变化，甚至神经元的结构亦发生改变，这必将影响大鼠的学习记忆能力，在四血管阻塞后的VaD大鼠与对照组大鼠比较，学习记忆能力明显降低。
         VaD患者脑内多种神经递质发生改变，其中，胆碱能系统明显受损，而学习记忆与中枢胆碱能系统关系极为密切。中枢胆碱能通路是构成学习记忆的主要通路，nAChR在大脑的学习、记忆、注意力的保持等方面起着重要作用［5，6］。大脑的海马中分布有丰富的nAChR，而海马是大脑在学习、记忆的过程中的一个重要结构，对小鼠的海马薄片的研究显示特定区域和时相的nAChR的活动能够加强或减弱神经突触的可塑性和调制形式［7］。研究表明，VaD时中枢胆碱能神经递质受体及其功能受损，在多发性梗死性痴呆患者大脑皮质中高亲和力nAChR受体显著丧失［8］，VaD患者α4β2型nAChR下降［9］。在本实验条件下，VaD模型鼠因慢性脑灌注不足造成nAChR  α3、 α4、 α7亚单位蛋白表达降低，因此脑缺血时能量耗竭，可导致细胞离子失衡，异常神经递质释放，胆碱能神经元丧失或破坏从而使nAChR表达减少。nAChR表达的降低可能是VaD 识认功能障碍分子机制的关键因素。本实验结果中，脑通复方制剂可上调nAChR  α3、 α4、 α7亚单位蛋白表达，这可能是脑通复方制剂组学习记忆优于模型组的原因。
       【参考文献】
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