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       【摘要】 
       目的建立测定人血清中章鱼胺含量的高效液相色谱学方法。方法采用phenomenex luna C18柱，以0.02 mol·L-1柠檬酸与0.02 mol·L-1磷酸二氢钠（7∶3）为流动相，流速为0.8 ml·min-1；柱温为30 ℃；检测波长λ = 220 nm。结果章鱼胺在0.006～50 μg·ml-1范围内线性关系良好,相关系数为0.999 9,平均加样回收率为105.6%，RSD为0.93%。最低检出浓度为0.006 μg·ml-1。结论该法操作简便，结果可靠，可用于人血清中章鱼胺含量的测定。初步检测，健康青少年血清章鱼胺含量为（4.03 ± 0.75） μg·ml-1，成年人为（4.50 ±1.10） μg·ml-1。
       【关键词】  高效液相色谱法； 章鱼胺； 人血清
       章鱼胺作为人体内源性的生物胺，在人体内有重要的生理作用。近年来药理学的研究显示了在人的中枢神经系统与交感神经系统自然产生的章鱼胺具有神经介质的功能，并且是一种优秀的选择性的β3-肾上腺素能受体激动剂［1］。相对于儿茶酚胺类化合物如肾上腺素和去甲肾上腺素，章鱼胺被认为是对β3-肾上腺素能受体最有选择性的物质。内源性章鱼胺和β3-肾上腺素能受体相互作用在生理学上的相关性在脂肪组织和其它表达β3-肾上腺素能受体的器官，特别是心脏和中枢神经系统被高度重视［2］。同时，章鱼胺在能量的平衡与代谢的调节上也有重要的作用［3～5］。章鱼胺在人体内可以因单胺氧化酶作用而被降解，而单胺氧化酶活性过强与抑郁症等精神疾患有关。用单胺氧化酶抑制剂对患者治疗时，其体内的章鱼胺会积累［6］。因此，人血清章鱼胺含量有可能作为一项血液临床生化检验项目，在病理学和药理学的研究中有潜在的价值。
       
       但章鱼胺生物学意义与生理学作用尚未被充分认识，为充分认识章鱼胺对各种疾病的作用，检测生物样品中尤其是人类血清中的章鱼胺含量是很有必要的。生物样品中章鱼胺含量的测定方法已经有很多种，包括放射酶学测定法［7］、毛细管气相色谱-负化学电离质谱法［8］、柱前衍生-RP-HPLC方法［9～11］、光纤LED诱导荧光毛细管电泳检测法［12］，虽然放射酶学测定法在过去经常用来测定生物样本中章鱼胺含量，但是实验操作过于复杂而且不稳定。而柱前衍生-RP-HPLC方法则实验操作也复杂且衍生试剂昂贵。在本研究中，我们建立了快速有效的不需衍生物处理的人血清中章鱼胺HPLC分析方法，同时测定了2个年龄段健康人群的血清章鱼胺含量，提供了人血清中章胺含量的初步数据，为与章鱼胺相关的病理学和药理学研究提供了有效手段。
       1   材料与仪器
       1.1  试剂
       章鱼胺标准品(盐酸盐,纯度≥95%)(Sigma公司)；磷酸二氢钠,柠檬酸均为分析纯,上海化学试剂采购供应站购买。
       1.2  仪器
       岛津SCL210A vp高效液相色谱仪；岛津SPD210A vp紫外检测器；岛津KUBOTA 520离心机，岛津SK8200 HP超声仪。
       1.3  血清样品
       血清样品由上海市市东医院检验科2008-06提供，A组为初中生毕业体验17人（年龄15岁），B组为某公司员工体检20人（年龄30～45岁，37.80±4.56，均为正常健康人群）。按常规抽血制备血清，除供血液生化检验用，余作本研究用。
       2  方法与结果
       2.1  色谱条件色谱柱为phenomenex luna C18(150 mm× 4.60 mm,5 μm)。以0.02 mol·L-1柠檬酸与0.02 mol·L-1磷酸二氢钠（7∶3）为流动相，pH调为3.0,流速:0.8 ml·min-1，紫外检测波长:220 nm,进样体积:20 μl。
       2.2  检测波长由于人血清中章鱼胺的含量很低，且人血清中成分复杂，检测人血清中章鱼胺的含量时容易受其他物质干扰，因此检测波长的正确选择对人血清中章鱼胺的检测非常重要。章鱼胺在274 nm和220 nm处都有吸收峰［2，13］，分别取章鱼胺标准品，用流动相配制成浓度分别为4，6，10 μg ·ml-1的3种浓度的章鱼胺溶液，按照分光光度法，在200～300 nm波长范围内用分光光度计进行扫描，通过扫描发现，3种浓度的章鱼胺溶液在274 nm处吸收较小，在220 nm吸收最大（见图1），且在220 nm处不受pH与浓度的影响，因此用HPLC检测时选择220 nm作为章鱼胺的检测波长。
       2.3  样品溶液的制备人血清用流动相稀释5倍,然后经微孔滤膜(0.45 μm)滤过,装入进样瓶中,备用。
       2.4  标准溶液的制备及鉴定称取章鱼胺标准品,用流动相配成总浓度为40 μg·ml-1的混合标准品溶液,按色谱条件进样20 μl得色谱图(见图2A)。
       2.5  方法学考察
       2.5.1  最小检测浓度取章鱼胺标准品溶液,进样20 μl,记录色谱图。当色谱峰的峰高为噪音3倍时(s/ n=3),章鱼胺的浓度为最小检测浓度,为0.006 μg·ml-1。
       2.5.2  线性关系将浓度为50 μg·ml-1的章鱼胺标准品,加流动相稀释成0,10,20,30,40,50 μg·ml-1的梯度溶液,按色谱条件检测,以峰面积Y与浓度X做标准曲线。经回归分析,章鱼胺在0.006～50 μg·ml-1范围内有良好的线性关系,回归方程为Y = 8 143.2X-305.1,r= 0.999 9。
       2.5.3  精密度取50 μg·ml-1的章鱼胺标准品溶液连续进样6次,在上述色谱条件下测定,章鱼胺峰面积的平均值为407 013,RSD = 0.7%,保留时间平均值为2.80，RSD = 0.2%，表明仪器精密度良好。
       2.5.4  稳定性取人血清样品用流动相稀释5倍,然后经微孔滤膜(0.45 μm)滤过,置于4℃冰箱中保藏，间隔一段时间，进样测定，RSD= 1.8%。表明章鱼胺3 d内在4℃冰箱中基本稳定。
       2.5.5  重复性精密量取人血清样品0.4 ml,5份,用流动相稀释5倍,制成5份样品溶液,进样测定,峰面积平均值为7 791，RSD= 1.3%。表明本方法重复性良好。
       2.5.6  加样回收率实验将已知含量的分析试样溶液取等量3份,加入不同量的章鱼胺标准品溶液,用流动相配成一系列不同浓度的溶液,照“2.3”方法制备,进样20 μl,测定，结果见表1。表1  章鱼胺回收率实验结果（略）
       2.6  章鱼胺含量的测定人血清样品用流动相稀释5倍,然后经微孔滤膜(0.45 μm)滤过,按色谱条件进样得色谱图(图2B), 图2C为添加章鱼胺对照品后的人血清样品色谱图。以标准曲线计算人血清样品中章鱼胺的含量,结果显示：健康青少年血清章鱼胺含量为（4.03 ± 0.75）μg·ml-1，成年人为（4.50 ±1.10）μg·ml-1。茅惠明等［9］用柱前衍生处理过的HPLC方法测得成年人血清章鱼胺含量为（4.8±1.4）μg·ml-1，通过比较，本文测出的结果与茅惠明等用柱前衍生处理过的HPLC方法测得的结果几乎一致。
       3  讨论
          
       章鱼胺在人血清中含量低，且人血清中成分复杂，HPLC检测中章鱼胺峰容易受到其它峰干扰，本研究在前述色谱条件下，流速为0.8 ml·min-1，紫外吸收波长选择在220 nm处，章鱼胺溶液在220 nm吸收最大，且不受pH与浓度的影响，降低了HPLC检测中其它峰对章鱼胺峰的干扰，有效地检测出人血清中章鱼胺的含量。与其他血清中章胺检测的HPLC方法相比较，本研究提供了一种快速灵敏的，不需衍生物处理的血清中章胺的HPLC分析方法。精密度与加样回收率等项实验的结果表明，本方法可直接上机测量，血清样品用量少，符合临床及药学检测的需求。
       
       本研究测定了两个年龄段健康人群的血清章鱼胺含量。提供了人血清中章胺含量的初步数据，为进一步建立人血清中章鱼胺含量的标准范围值作了一个初期的准备，为多种疾病相关的病理学与药理学研究提供了一个新的途径。其他不同人群相关的血清章鱼胺含量研究也在进行中，有待进一步报道！
       
       致谢：上海市市东医院检验科金立钢主任提供血清样本，特此致谢。
       【参考文献】
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