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       【摘要】 
       目的研究武陵山血红栓菌菌丝体液体培养的最适培养基及培养条件。方法利用液体深层培养法筛选血红栓菌菌丝体的最适培养基和最适培养条件。结果血红栓菌菌丝体液体培养的最适培养基为葡萄糖3.0%，牛肉膏0.75%，磷酸二氢钾0.20%，硫酸镁0.05%，维生素B1 0.01 mg/ml；最适培养条件为培养液初始pH 6.0，装量75 ml/250 ml三角瓶装，摇瓶速度180 r/min，培养温度25℃，发酵周期7 d。结论用深层培养法生产武陵山血红栓菌菌丝体，菌丝体的产量最大为1 276.7 mg/ml。
       【关键词】  血红栓菌； 深层发酵； 菌丝体
       血红栓菌Trametes sanguinea (L.:Fr.) Lloyd隶属于担子菌亚门、层菌纲、非褶菌目、多孔菌科、栓菌属［1］。血红栓菌夏秋季生于栎、槭、杨、柳等阔叶树和松、杉等针叶树枯倒木上群生或叠生；在我国主要分布于云南、贵州、广东、四川和重庆等省市［2］。血红栓菌具有生肌、行气血、化痰、除风湿、止痒、顺气、止血；有抑制癌细胞作用，对小鼠肉瘤180的抑制率为90%。血红栓菌子实体还含有对革兰氏阴、阳性菌有抑制作用的多孔蕈素。此外，还用于消炎，用火烧研粉敷于疮伤处［1,3］。
       
       国内外文献对普通灵芝属类木质菌研究较多，对血红栓菌的研究报道较少，对它的菌丝体发酵几乎没有相关的文献报道。在血红栓菌菌丝体成熟后就形成木质化子实体，不易加工。对血红栓的菌丝体发酵工艺条件研究，可以为血红栓菌菌丝体作为原料生产医药产品提供科学依据。
       1  材料
       1.1  菌种血红栓菌，200808采集自武陵山彭水县桑柘乡野生血红栓菌子实体，经组织分离得到纯菌种。
       1.2  培养基碳源、氮源基础培养基（磷酸二氢钾0.10%，硫酸镁0.05%，维生素B1 0.01 mg/ml）；无机盐基础培养基（葡萄糖2.0%，牛肉膏0.50%，维生素B1 0.01 mg/ml）［4］。
       2  方法
       2.1  液体发酵将10%种子液接入基础培养基中，培养基装量为75 ml /250 ml三角瓶，25℃，180 r/min振荡培养7 d［5］。
       2.2  菌丝体产量测定方法培养得到的菌丝体经离心、过滤、用纯净水洗涤3次，于60℃干燥箱内烘干至恒重，用电子天平称重。
       3  结果
       3.1  发酵培养基的筛选
       3.1.1   碳源对菌丝体生长的影响将2.0%葡萄糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉和玉米粉分别加入基础培养基中进行试验，以基础培养基为对照，结果如图1。菌丝体产量以葡萄糖最大为 570.3 mg/100 ml，比对照增加72.6%；蔗糖最小为290.1 mg/100 ml，比对照增加12.2%。碳源对血红栓菌菌丝体生长的影响大小依次为：葡萄糖>乳糖>玉米粉>可溶性淀粉>基础培基>蔗糖。
       3.1.2  氮源对菌丝体生长的影响在基础培养基中分别加入0.50%牛肉膏、黄豆粉、蛋白胨、尿素和硫酸铵进行试验，以基础培养基为对照，结果如图2。菌丝体产量以牛肉膏最大为583.2 mg/100 ml，比对照增加83.1%；尿素最差为15.5 mg/100 ml，比对照减少95.1%。氮源对血红栓菌菌丝体生长的影响大小依次为：牛肉膏>黄豆粉> 蛋白胨>基础培养基> 硫酸铵>尿素。
       3.1.3  无机盐对菌丝体生长的影响将0.05%硫酸钾、硫酸钙、磷酸二氢钾、硫酸镁和硫酸锰分别加入基础培养基中进行试验，以基础培养基为对照，结果如图3。从图3可见，菌丝体产量以磷酸二氢钾最高为582.4 mg/100 ml，比对照增加65.6%；硫酸镁列其次为561.7 mg/100 ml，比对照增加59.7%；硫酸钙最低为313.0 mg/100 ml，比对照减少11.0%。无机盐对血红栓菌菌丝体生长的影响大小依次为：磷酸二氢钾>硫酸镁> 硫酸锰 >硫酸钾> 基础培养基>硫酸钙。
       3.1.4  正交实验根据以上实验结果，选择葡萄糖、牛肉膏、磷酸二氢钾和硫酸镁4因素设计4因素3水平L9（34）正交实验， 确定血红栓菌菌丝体生长的最适培养基组成。因素和水平见表1。表1  L9(34)正交实验因素与水平（略）
       
       实验结果如表2。从表2可知，葡萄糖的极差值最大为716.5 mg/100 ml，其次是牛肉膏、硫酸镁为71.5 mg/100 ml和62.3 mg/100 ml，磷酸二氢钾最小为54.7 mg/100 ml。最佳培养基组成为A3B3C2D1，即葡萄糖3.0%、牛肉膏0.75%、磷酸二氢钾0.20%和硫酸镁0.05%，此时，菌丝体产量为1 276.7 mg/ml。表2  正交实验结果与分析（略）
       3.2  发酵条件的筛选
       3.2.1  培养温度对菌丝体生长的影响将接种后的摇瓶分别置于19，22，25，28，31，34℃，180 r/min振荡培养7 d。结果发现，菌丝体在19～34℃范围内均可生长，以25℃菌丝生长最好，菌丝体产量最高；当培养温度低于25℃时，生长速度减慢；温度高于25℃时，则生长亦较差（见表3）。表3  温度对血红栓菌菌丝体生长的影响（略）
       3.2.2  装液量对菌丝体生长的影响在250 ml三角瓶中分别盛25，50，75，100，125，150 ml培养液，25℃，180 r/min振荡培养7 d（见表4）。从表4可知，装液量从25 ml增加到75 ml时，菌丝体产量逐渐增加，到75 ml达到最大（按100 ml计）；之后，随着装液量的增加，菌丝体产量呈下降趋势。表4  装液量对血红栓菌菌丝体生长的影响（略）
       3.2.3  摇瓶转速对菌丝体生长的影响将已接种的摇瓶分别置于90，120，150，180，210，240 r/min振荡培养器上，25℃培养7 d（表5）。随着摇床转速增大，瓶中溶氧量增大，菌丝体生长速度加快；当转速为180 r/min时，菌丝体的产量达到最大；此后，随着转速继续增加，菌丝体产量逐渐下降。表5  摇床转速对血红栓菌菌丝体生长的影响（略）
       3.2.4  培养液pH对菌丝体生长的影响调节培养液初始pH分别为5.0，5.5，6.0，6.5，7.5，7.5，25℃培养7 d。在pH为5.0～7.0范围内，菌丝体均能正常生长，产量以pH 6.0为最高；pH低于6.0时，菌丝体产量呈下降趋势；pH高于6.0时，菌丝体产量亦随pH升高而降低（见表6）。表6  pH对血红栓菌菌丝体生长的影响（略）
       3.2.5  培养时间对菌丝体生长的影响在250 ml三角瓶中分别盛75 ml培养液，25℃，180 r/min振荡培养。结果见表7。结果表明，菌丝体产量随培养时间延长逐渐增加；到第7天时，菌丝体产量达到最大；此后，继续培养则菌丝体的产量随培养时间的延长而下降。表7  培养时间对血红栓菌菌丝体生长的影响（略）
       4  讨论
          
       实验结果表明，血红栓菌菌丝体生长的最适培养基组成为葡萄糖3.0%，牛肉膏0.75%，磷酸二氢钾0.20%，硫酸镁0.05%，维生素B1 0.01 mg/ml。血红栓菌深层发酵菌丝体生长的最适初始pH为6.0，温度为25℃，转速为180 r/min，培养时间为7 d时，菌丝体的产量最大为1 276.7 mg/ml。
       
       血红栓菌菌丝对葡萄糖、玉米粉和蔗糖等6种碳源均能利用，但以葡萄糖的利用效率最高，更适合于血红栓菌菌丝体生长。在6种氮源中，菌丝体对牛肉膏的利用效率最高，尿素的利用率最低。磷酸二氢钾和硫酸镁对菌丝体生长均有促进作用，而添加硫酸钙后菌丝体生长较差，其作用机制有待进一步研究。
       
       血红栓菌菌丝体的产量不仅与液体培养基组成有关，而且与培养液pH、摇瓶装液量、转速、培养温度和培养时间等密切相关。通过深层发酵可以工厂化生产血红栓菌菌丝体，而且菌丝体质量稳定，有利于在制药生产中的应用。
       【参考文献】
         　［1］卯晓岚. 中国大型真菌［M］.郑州:河南科学技术出版社, 2000:448.
       
       ［2］袁明生,孙佩琼.四川蕈菌［M］.成都:四川科学技术出版社, 1995:356.
       
       ［3］卯晓岚. 中国经济真菌［M］.北京:科学出版社, 1998: 411.
       
       ［4］陈今朝, 戴玄,谭永忠, 等.平菇液体种子培养基优化［J］.江西农业大学学报, 2008,30(5):915.
       
       ［5］杨芳,王新风,朱骏, 等.肋脉羊肚菌液体培养条件的研究［J］.食品科学, 2008,29(2):280.