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       【摘要】 
       目的研究西番莲叶有效成分抑制其非酶糖基化作用。方法运用GF254薄层层析，HPLC等对西番莲叶石油醚部位进行提取分离。结果石油醚部位的主要黄酮物质为芸香苷。结论芸香苷为西番莲叶石油醚部位抑制蛋白质非酶糖基化作用的主要成分。
       【关键词】  西番莲； 芸香苷； 非酶糖基化； 高效液相色谱； 气相色谱-质谱联用
       西番莲（Passiflora）是西番莲科(Passifloraceae)西番莲属的多年生常绿藤本植物。西番莲果大，可鲜食，其汁蛋黄色，尤其突出的是，其果汁所含的六十多种酯类等香味成分使其具有强烈诱人的风味和香气，被誉为“百香果”［1］。
       
       祖国医学在治疗糖尿病及其并发症方面有悠久的历史，如何从中草药中寻找抑制蛋白质糖基化的有效成分是一项非常有价值的工作，目前这方面的研究还不多。
       
       蛋白质非酶糖基化在糖尿病血管并发症的发生中占有重要地位。蛋白质与羰基化合物(葡萄糖、果糖和乙二醛等)发生非酶糖基化反应，最终可形成一系列不可逆的糖基化终产物AGEs。AGEs可与蛋白质发生交联，改变蛋白质的生理活性，引起一系列病理生理改变。此外，AGEs与动脉粥样硬化的发生发展密切相关［2］。因此，如何抑制蛋白质的非酶糖基化是近年来国内外研究的热点。目前国外已证实，氨基胍,二甲双胍可抑制蛋白质的糖基化，并相继开发出一系列药物［3］。
       
       本文通过对西番莲叶用95%乙醇浸泡 7 d［4］，用石油醚萃取分离，对乙醇和石油醚部分薄层分析、HPLC分析，并对提取物进行了抑制糖基化作用的研究。
       1  仪器与材料
       1.1  仪器高效液相色谱（日本岛津公司)；pH-3C型酸度计 ；荧光分析仪器（日本岛津）；DHG-9246A型电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）；FW-117中草药粉碎机（天津泰斯特仪器有限公司）；旋转蒸发仪。
       1.2  试剂乙醇，醋酸乙酯，石油醚，正丁醇,乙二醛，磷酸二氢钠，磷酸氢二钠，葡萄糖，D-果糖，叠氮化钠，牛血清白蛋白，盐酸二甲双胍，芸香苷。
       
       2  方法
       2.1  提取与分离西番莲叶样品于2007-10晴天上午10时采自海南屯昌南坤，在65℃经干燥箱干燥3 d，后经粉碎制得。西番莲叶粉碎后,用95%的乙醇浸泡7 d，然后用石油醚浸泡萃取，抽真空过滤，旋转蒸发仪分离得到浸膏，用石油醚-醋酸乙酯（82∶9）做展开剂，进行薄层色谱，得到两层，将第1层Rf=0.91用石油醚溶解，备用。
       2.2  鉴定HPLC的色谱条件：用2%的乙酸溶液和乙腈（20∶80）做流动相，天津天和C18柱，250 mm×4.6 mm，波长 337 nm,灵敏度0.01AuFs,柱温30℃，流速0.8 ml/min，进样量20 μl ［5］。芸香苷和石油醚部位的薄层分析提取物的HPLC的色谱见图1～2。
        通过对上面HPLC谱图分析可知，芸香苷对照品的主峰出峰时间与西番莲石油醚部位的主峰出峰时间相同，可以得出石油醚部位通过薄层色谱分离得到了芸香苷。 
       2.3  非酶糖基化
       2.3.1   西番莲提取物的制备文献报道了芸香苷和西番莲具有抑制糖基化作用［6］，但是石油醚部位抑制蛋白质非酶糖基化作用的研究还未见报道。所以主要对石油醚部位进行了非酶糖基化研究。
       
       称取西番莲粉5 g，用150 ml 95%的乙醇浸泡7 d，重复3次，减压抽滤用下面的滤液到旋转蒸发仪蒸发得到浸膏，用水溶解所得浸膏，依次用12，9，6 ml的石油醚、醋酸乙酯、正丁醇各萃取3次，将所得的不同提取层的溶液置于60℃干燥，得到各提取层所得的石油醚、醋酸乙酯、正丁醇、水层提取物质量，每一层各取10 mg用无水乙醇溶解定容到50 ml备用。
       2.3.2   溶液配制pH=7.4磷酸盐缓冲液（PBS）的配制［7］：精密称取Na2HPO4 7.163 5 g溶解至100 ml, NaH2PO4 0.936 8 g溶解至30 ml，配制成了0.2 mol/L的Na2HPO4 100 ml和0.2 mol/L的NaH2PO4 30 ml，然后按81∶19（体积比）配制成0.2 mol/l的磷酸盐缓冲液100 ml。
       2.3.3   蛋白质非酶糖基化反应根据文献，反应液由12 mg/ml乙二醛，10 mg/ml牛血清白蛋白和2 mg/ml叠氮化钠在pH 7.4，0.2 mol/L的磷酸缓冲液，2 ml反应液与2 ml水混合，于37℃恒温水浴箱避光孵育，15 d测定荧光强度(荧光分光光度计，日本岛津公司。测定条件:激发波长370 nm，狭缝3 nm，发射波长440 nm，狭缝3 nm)。
       2.3.4   药物干预试验将2 ml提取液与2 ml pH 7.4的PBS 90℃下混合40 min，去除有机物，再加入2 ml反应液，37℃恒温水浴箱避光孵育。芸香苷和二甲双胍(100 mmol/L)溶液2 ml分别与2 ml反应液作为阳性药物对照，2 ml水与2 ml反应液混合作为对照组。
       2.3.5   蛋白质糖基化抑制率的测定 根据糖基化终产物有自发荧光的特性，采用荧光法测定荧光值(测定条件:激发波长370 nm，狭缝3 nm，发射波长440 nm，狭缝3 nm)。根据下列公式计算抑制率：
       
       I=a-ba
       
       式中，I为抑制率;a为对照，即不加样品液的荧光强度;b为样品荧光强度。
       2.3.6    数据处理采用方差分析检验其显著性，中药抑制率指标均以±s表示。
       3  结果
          
       取定容于50ml的石油醚部位、醋酸乙酯部位、正丁醇部位、水层部位各2 ml，分别加入2 ml反应液混合。
       
       取定容于50 ml的石油醚部位，精密量取2,1.6，1.2，0.8，0.4 ml分别与2 ml反应液混合，分别命名为样1，样2，样3，样4，样5。
       
       西番莲提取物的抑制率结果见图3，西番莲石油醚部位的荧光强度和抑制率见图4。
       
       通过图3，可以得出芸香苷的抑制率最强，其次为石油醚部位，而且石油醚部位的作用强于二甲双胍，西番莲抑制蛋白质非酶糖基化的研究还是有一定的研究价值。通过图4可知，西番莲石油醚部位的抑制率是随着浓度的减小而减小。
       4  讨论
          
       本文通过对西番莲叶的石油醚提取物进行了薄层分析，得出石油醚部分含有芸香苷，芸香苷具有抑制蛋白质非酶糖基化作用，比较了西番莲的有效成分芸香苷和二甲双胍的作用效果，发现芸香苷效果明显强于二甲双胍，可见西番莲叶应用可能会为糖尿病患者带来福音。
       【参考文献】
         　［1］陈智毅,李升峰,吴继军，等.西番莲的加工利用研究［J］.现代食品科技,2006,22(1）:186.
       
       ［2］Vlassarah.Advanced glcoslation end-produtes and atherosclerosis［J］.Ann Med,1996,28:419.
       
       ［3］陈睿杰.刘允坚.糖尿病治疗药物的研究现状［J］.广东药学院学报，2001,17:131.
       
       ［4］Martina Rudnicki，Marcos Roberto de Oliveira，Tiago da Veiga Pereira ,et al.Antioxidant and antiglycation properties of Passiflora alataand Passiflora edulis extracts［J］.Food Chemistry，2007,100: 719.
       
       ［5］Cíntia A. M. Pereira, Janete H. Yariwake, A HPTLC Densitometric Determination of Flavonoids from Passiflora alata, P. edulis,P. incarnata and P. caerulea and Comparison with HPLC Method［J］.Phytochemical Analysis Phytochem. Anal. 2004，15, 241.
       
       ［6］梁海燕，古德祥.类黄酮化合物对糖基化反应终产物AGE的抑制作用［J］.天然产物研究与开发， 2001，6（6）：14.
       
       ［7］黄达明，张志才，连宾，等.22种醇提物抑制蛋白质非酶糖基化作用的研究［J］.食品科学，2007，28（5）：41.