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       【摘要】 
       目的探讨了香菇多糖对IL-2和IL-6表达及肿瘤细胞周期的影响。方法昆明小鼠随机分为4组：正常对照组，肿瘤（S180）模型组，肿瘤环磷酰胺组，肿瘤香菇多糖组。放免法检测各组小鼠血清IL-2和IL-6水平、镜下观测计算小鼠腹腔巨噬细胞吞噬率和吞噬指数、流式细胞仪检测肿瘤细胞周期。结果香菇多糖可使荷瘤鼠IL-2含量升高(P<0.01)，IL-6含量降低(P<0.01)；香菇多糖可提高荷瘤鼠腹腔巨噬细胞吞噬率（P<0.01）和吞噬指数（P<0.01）；使Gl期细胞增多，S期和G2／M期细胞减少，使肿瘤细胞的增殖指数明显下降（P<0.01）。结论香菇多糖可抑制荷瘤机体Th1/ Th2细胞的平衡向Th2细胞漂移，活化巨噬细胞功能，减低肿瘤细胞的增殖指数。
       【关键词】  香菇多糖；S180；细胞周期；白细胞介素-2；白细胞介素-6
       我们之前的研究已证实，香菇多糖(lentinan,LNT)能使荷瘤鼠脾指数增加, 脾白髓相对面积及脾小体个数明显增加；能增加胸腺树突状细胞数量及促进其分化成熟；使外周血淋巴细胞数量显著增加；影响荷瘤机体T细胞亚群的比例，促使荷瘤机体C细胞的增殖与活化，诱导细胞毒性T细胞的产生，最终直接或间接杀伤肿瘤细胞［1，2］。本实验探讨香菇多糖对荷瘤鼠血清IL-2和IL-6表达及肿瘤细胞周期的影响，以期为香菇多糖的抗肿瘤作用提供更多的依据。
       1  材料与仪器
          
       小鼠S180细胞株（Sarcoma180）由中国医学科学院医药研究所购进，本院科研中心传代培养。注射用香菇多糖：南京康海药业有限公司产品。环磷酰胺，江苏恒瑞医药股份有限公司生产。细胞周期流式分析试剂盒，购自上海杰美基因医药科技有限公司。IL-2和IL-6 （放免）试剂盒，购自北京福瑞生物工程公司。SN-695型放免γ测量仪：上海核福光电仪器有限公司产品。BD Calibur流式细胞仪，美国Becton Dickinson公司产品。Olympus显微镜。SPSS14.0统计软件包。
       
       清洁级昆明小鼠40只，雌雄各半，6～8周龄，体质量20～24 g，购自江西中医学院实验动物中心，卫生许可证号：SCXK（赣）2006-0001，实验动物质量合格证号： JZDW 2008-0205。
       2  方法
       2.1  荷瘤S180鼠模型的建立按本课题组既往操作程序制作［1］。
       2.2  动物分组及处理 
       小鼠随机分为4组。第Ⅰ组为正常对照组，右前腋皮下注射0.2 ml生理盐水，9 d后处死；第Ⅱ组为肿瘤模型组，第Ⅲ组为肿瘤环磷酰胺组，第Ⅳ组为肿瘤香菇多糖组，后3组于接种肿瘤后第2天始分别每日腹腔注射生理盐水0.2 ml，环磷酰胺(Cyclophosphamide,CYP)0.2 ml（每只每次1 mg），以及香菇多糖0.2 ml(每只每次0.025 mg)，共7次。均于最后1次给药后第2日处死。
       2.3  血清IL-2和IL-6的测定小鼠摘除眼球取血置抗凝管中，分离血清，-70°C保存。严格按试剂盒操作程序检测血清IL-2和IL-6的水平。
       2.4  小鼠腹腔巨噬细胞(macrophage，Mφ)吞噬功能的测定取材前1天所有小鼠腹腔注射2%无菌淀粉1ml。取材当日小鼠腹腔注射5%鸡红细胞（chicken red blood cell,CRBC）1 ml，30 min后，腹腔注射PBS 1 ml，轻轻按揉腹壁1 min，吸出腹腔液滴片。置37°C湿盒孵育30min后，用PBS冲洗，去除未贴壁Mφ和游离CRBC，纯甲醇固定7～8 min，自然晾干，用瑞士染液进行染色。在显微镜高倍镜下观察，每张片随机计数200个Mφ中吞噬CRBC的Mφ数及吞噬的CRBC总数。并计算Mφ的吞噬百分率和吞噬指数。计算公式为：吞噬百分率（%）=吞噬CRBC的Mφ总数/观察到的Mφ总数×100% ；吞噬指数=被吞噬的CRBC总数/观察到的Mφ总数。
       2.5  肿瘤细胞周期的测定剥离肿瘤后，取适量剪碎，胰蛋白酶消化30 min，以含血清培养基终止反应，经研磨后200目过滤，PBS离心洗涤3次后，200目过滤，调整细胞浓度为5×106/ml，4℃待测。检测时，取5×105个细胞，按流式细胞仪操作规程上机检测。并用美国BD公司提供的相关软件将所得数据进行曲线拟合分析，计算相应的DNA含量，根据DNA含量的变化，得出细胞周期中各期细胞（G0/G1期，S期，G2/M期）的百分比及计算增殖指数（PI）。
       
       PI（%）=S+G2/MG0/G1+S+G2/M×100%
       2.6  统计学处理实验数据 以±s表示，采用SPSS14.0统计软件包进行统计学分析。经正态性检验和方差齐性检验满足正态分布和方差齐同后作单因素方差分析，组间差异用SNK方法检测。
       3  结果
       3.1  香菇多糖对各组小鼠血清IL-2和IL-6的影响结果见表1。表1  各组小鼠血清细胞因子结果比较 (略)
       3.2  香菇多糖对荷瘤鼠腹腔巨噬细胞吞噬率和吞噬指数的影响正常对照组小鼠腹腔Mφ通常吞噬1～2个CRBC，荷瘤鼠大部分Mφ未吞，或只吞1个CRBC，而香菇多糖组Mφ吞噬率和吞噬指数均明显增强，与其它各组比较，其差异均有统计意义（P<0.05或P<0.01）（见图1），且通常一个Mφ吞噬2～3个，甚至6～8个CRBC（见图2）。
       3.3  香菇多糖对小鼠S180实体瘤细胞周期的影响香菇多糖对小鼠S180实体瘤细胞周期的影响研究结果表明，香菇多糖对肿瘤细胞的细胞周期动力学改变是有影响的。结果见表2。表2  香菇多糖对小鼠S180实体瘤细胞周期的影响(略)
       4  讨论
          
       IL-2 和IL-6是宿主生物效应调节剂（ biological response modifiers，BRM）系统中调节机体细胞免疫功能的两种重要的细胞因子。IL-2由Thl亚群分泌，具有诱导肿瘤细胞凋亡的作用［3］。IL-6由Th2亚群分泌，对肿瘤具有双向调节作用，即对肿瘤细胞的增殖既有促进作用又有抑制作用。有资料证明肿瘤机体血清中IL-6多呈高表达状态［4，5］。本实验肿瘤模型组和环磷酰胺组血清IL-2 水平显著低于正常对照组（P<0.05，P<0.01），而IL-6水平则显著高于正常对照组（P<0.01，P<0.01），说明在发生肿瘤和给予化疗时机体的免疫能力下降。给予香菇多糖后，白介素水平有所恢复，使荷瘤鼠IL-2含量升高(P<0.01)，IL-6含量降低(P<0.01)，抑制荷瘤机体Th1/ Th2漂移而增强抗肿瘤免疫反应。香菇多糖的这种BRM样作用机制目前尚不十分清楚 。许多多糖对机体的免疫调节作用和抗肿瘤活性是经由激活巨噬细胞，增强其吞噬功能和免疫调节功能以及分泌多种生物活性物质而起作用的［6，7］。已有研究证明：香菇多糖可诱导小鼠腹腔巨噬细胞NO生成增加，细胞内酸性磷酸酶活性和精氨酸酶活性升高［8，9］，本实验结果表明香菇多糖可提高荷S180小鼠腹腔巨噬细胞吞噬率和吞噬指数，与其它各组比较有显著性差异（P<0.05或P<0.01）。结果与王慧铭［10］的报道相符。从表2可见，香菇多糖可使肿瘤细胞周期阻滞于G0/G1期，细胞数明显增加（P<0.01）；可减少增殖细胞在S期的分布，细胞数明显减少（P<0.01）；使肿瘤细胞的增殖指数明显下降（从61.49%降至37.08%）（P<0.01）。表明香菇多糖可以抑制细胞进入S期，影响肿瘤细胞内DNA的复制和合成，从而使细胞在G1期堆积，最终抑制肿瘤细胞的增殖。我们推测以上结果主要由香菇多糖活化巨噬细胞所致：巨噬细胞内酸性磷酸酶活性升高，增强了溶酶体酶的消化能力；巨噬细胞的NO生成增加，从而发挥细胞毒作用，抑制和破坏肿瘤细胞；巨噬细胞内精氨酸酶活性明显升高，可消耗肿瘤细胞的精氨酸，干扰肿瘤细胞的肽类和蛋白质的合成，进而干扰DNA和RNA的合成，使肿瘤细胞的增殖受到抑制。
       【参考文献】
         ［1］林卡莉,吕军华,徐鹰,等. 香菇多糖调节荷瘤小鼠的免疫功能［J］.解剖学杂志,2009, 32(2):166.
       
       ［2］林卡莉,辛赣海,陈方.香菇多糖改善S180荷瘤鼠免疫功能的体视学研究［J］.中国组织化学与细胞化学杂志,2008, 17(4):398.
       
       ［3］Mekhail T, Wood L, Bukowski R.Interleukin-2 in cancer therapy: uses and optimum management of adverse effects［J］. BioDrugs. 2000,14(5):299.
       
       ［4］戴东,李明意,陈群,等.动态检测乳腺癌患者手术前后血清IL-6、VEGF-A表达的临床意义［J］.中国实验诊断学,2007,11(8):1016.
       
       ［5］郭军鹏,李红,纪影实,等.缝裂层孔菌调节荷瘤小鼠免疫功能的实验研究［J］.中国实验诊断学,2007,11(4):514.
       
       ［6］Wasser SP.Medicinal mushrooms as a source of antitumor and immunomodulating polysaccharides［J］.Appl Microbiol Biotechnol.2002,60(3) :258.
       
       ［7］Ooi VE,Liu F.Immnunomodulation and anti-cancer activity of polysacharide protein complexes ［J］.Curr Med Chem，2000,7(7):715.
       
       ［8］Kupfahl C, Geginat G, Hof H. Lentinan has a stimulatory effect on innate and adaptive immunity against murine Listeria monocytogenes infection. Int Immunopharmacol，2006,6(4):686.
       
       ［9］候敢,黄迪南,祝其锋.香菇多糖对巨噬细胞一氧化氮合酶生成和细胞内还原型谷胱甘肽的影响［J］.中草药,2002,33(3):245.
       
       ［10］王慧铭,夏明, 夏道宗,等.香菇多糖抗肿瘤作用及其机制的研究［J］.浙江中西医结合杂志,2006,16(5):291.