葛根芩连汤上清液与沉淀中异黄酮类成分指纹图谱的研究
作者:谭晓梅, 闫琰, 罗佳波, 张玮
《时珍国医国药》 2007年 第2期
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【关键词】 葛根芩连汤;,,指纹图谱;,,上清液;,,沉淀
摘要:目的通过应用三维高效液相色谱,建立葛根芩连汤上清液和沉淀中异黄酮指纹图谱的方法,明确其上清液和沉淀中异黄酮类成分的异同,以便进一步探讨该方的配伍规律。方法葛根素、大豆苷元用甲醇溶解制成对照品溶液,葛根药材水煎液、葛根芩连汤上清液、沉淀用二甲基亚砜溶解制成供试品溶液,采用三维高效液相谱对葛根芩连制剂进行指纹图谱实验研究,流动相为甲醇 水 乙腈梯度洗脱,扫描波长为200~400 nm。结果在梯度洗脱条件下,葛根芩连汤上清液的HPLC指纹图谱中有6个标识性共有峰,葛根芩连汤沉淀的HPLC指纹图谱中有4个标识性共有峰。但峰面积仅占上清液的8%(以葛根素计)。结论 葛根芩连汤配伍产生的沉淀中亦有异黄酮类有效部位,但与上清液比较,含量较低。说明君药葛根中异黄酮类成分与方剂中的其他物质络合而产生沉淀,且该沉淀溶于二甲基亚砜。
关键词:葛根芩连汤; 指纹图谱; 上清液; 沉淀
葛根芩连汤原载于东汉张仲景《伤寒论》中,由葛根、黄芩、黄连、炙甘草4味中药组成。其处方为:葛根15 g,黄芩9 g,黄连9 g,甘草(炙)6 g。其中葛根为君药,黄芩、黄连为臣药,炙甘草为使药。功效主要是表里双解,清热止痢。中药配伍在煎煮过程中,其成分发生复杂的变化,其中沉淀反应是中药配伍共煎时常见的变化。日本学者于1978年首次报道黄连配伍甘草、大黄时小檗碱等生物碱在煎剂中的含量大幅度下降[1]。其沉淀能溶于二甲基亚砜,部分溶于吡啶、稀酸、稀碱,微溶于冷甲醇、乙醇,不溶于氯仿、石油醚、在热甲醇中能不断溶解,冷后又生成沉淀[2]。沉淀使煎液中有效成分的含量降低 ,且有研究表明,黄连黄芩配伍产生的沉淀,能够在胃肠内溶解[3],但葛根芩连汤配伍后究竟是哪些成分发生沉淀反应,目前尚未有明确的结论。本实验试图通过指纹图谱的方法,探明其上清液与沉淀中异黄酮成分的异同,以明确沉淀物中是否有异黄酮类成分。
1 仪器与试药
美国惠普HP 1100高效液相色谱仪,G1315A紫外 可见光二级管阵列检测器,离心机(北京医用离心机厂),甲醇(分析纯,天津大茂学试剂厂)、甲醇(色谱纯,MERCK),乙腈(色谱纯),葛根素对照品753 200007、大豆苷元对照品1502 200101 (中国药品生物制品检定所);葛根、黄芩、黄连、甘草药材由广东省致信药材公司提供,经本校中药鉴定教研室刘传明讲师鉴定,分别为豆科植物野葛Pueraria lobata Ohwi,唇形科植物黄芩Scutellaria baicalensis Georgi干燥根茎,毛茛科植物黄连Coptis chinensis Franch.干燥根茎,豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.干燥根茎(蜜炙)。
2 方法
2. 1 葛根芩连汤标准汤剂供试品溶剂的制备葛根15 g,黄芩9 g,黄连9 g,甘草6 g,烧杯中加水400 ml,先煎葛根20 min,余药共煎30 min,煎两次,趁热120目滤布滤过,合并滤液。90℃定容至1 000 ml,静置室温后,于冰箱4℃内静置24 h,取出,离心以3 000 r/min,得到上清液,定容到1 000 ml,为供试品溶液1;沉淀于烘箱内50℃干燥24 h后,加适量二甲基亚砜使溶解,定容到1 000 ml,过滤,得供试品溶液2。
2.2 色谱条件 甲醇∶水∶乙腈梯度洗脱[4,5]检测波长的选择。结果见表1。依据DAD检测的三维图谱,选择可将全谱物质均能检测到的250 nm作为最后的检测波长(图1~3)。
表1 梯度洗脱条件(略)
图1 葛根药材水煎液(略)
图2 葛根全方上清液(略)
图3 葛根芩连全方沉淀(略)
2. 3 对照溶液的制备
2.3.1 对照药材溶液的制备取葛根药材15.09 g,水煎煮2次,煎煮时间分别为30,20 min,滤过,煎煮液定容到1 000 ml,即得。
2.3.2 对照品溶液的制备精密称取葛根素、大豆苷元各5 mg,于50 ml容量瓶中,加甲醇溶解后定容至刻度,即得。
2.4 样品测定精密吸取各溶液10 μl,注入高效液相色谱仪(HPLC)中,参照高效液相色谱法,结合指纹图谱的要求进行实验,以对照药材为参照色谱,测定并记录色谱图,以中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版采用多点校正的方法进行计算分析。
2.5 对照实验 吸取对照品溶液10 μl,注入HPLC,得知21.5 min左右的峰为葛根素,40 min左右为大豆苷元。
2.6 精密度实验取对照药材溶液连续进样6次,测得峰共有15个,其中6个共有峰相对保留时间RSD小于1%,其共有峰的峰面积占总峰面积的78%~83%,各谱图相似度为0.999。结果见图4。
图4 对照药材指纹色谱图(略)
2.7 重复性实验平行做6份汤剂,同供试品1的制备方法,测定,测得峰共有18个,其中6个主要峰保留时间RSD小于1%,共有峰占总峰面积的56%~62%,各谱图相似度为0.992~0.995,表明其重复性实验较好。结果见图5。
图5 葛根芩连汤上清液重复性考察指纹色谱图(略)
2.8 稳定性实验取供试品溶液1,分别在0,2,4,6,8,12,24 h,测得其中6个主要峰保留时间RSD小于2%,共有峰占总峰面积的55%~67%,各共有各谱图相似度为0.989~0.997,表明样品溶液在24 h内稳定。结果见图6。
图6 葛根芩连汤上清液稳定性考察指纹色谱图(略)
3 结果
葛根药材水煎液中在250 nm左右有最大吸收的物质有6种,其紫外吸收行为如图1,指纹图谱见图7,葛根芩连全方水煎液的上清液中最大吸收为250 nm的主要吸收峰的紫外吸收行为见图1,指纹图谱见图8,葛根芩连全方沉淀中最大吸收在250 nm附近的主要吸收峰,其紫外吸收行为见图3,沉淀的指纹图谱见图9。
图7 葛根药材水煎指纹图谱(略)
图8 葛根全方上清液指纹图谱(略)
图9 葛根芩连全方沉淀指纹图谱(略)
4 讨论
由图7~9指纹图谱可以看出,葛根芩连全方上清液与葛根水煎药材均具有特征性色谱1~6号峰,而葛根芩连全方沉淀中仅有3~6号峰,上清液中1号峰、2号峰、5号峰在所有峰中所占组分较药材中高(以葛根素为1计),4号峰较药材中低,6号峰两者含量相当。从总体上讲,上清液与沉淀中葛根素含量之和与药材单煎的含量相当。沉淀产生的原因可能是由于黄连中生物碱类成分为碱性,而葛根中的异黄酮类成分呈酸性,全方煎液为酸性,可能由于煎煮过程中pH值的改变而产生沉淀。黄连中的小檗碱、巴马丁、药根碱、黄连碱均为季铵碱,其结构中的氮原子以离子状态存在,同时含有以负离子形式存在的羟基,而葛根中的葛根素具有7位酚羟基,大豆苷元具有4"位酚羟基[6],可能与氮离子络合形成络合物。本实验结果表明,配伍后葛根也与方剂中其他药物发生沉淀反应,产生的沉淀中存在异黄酮类成分,但含量较低,可能是因为全方制剂中含有黄芩黄酮类、甘草酸类成分,三者存在竞争机制,其具体机制有待于进一步探讨,在制备成方制剂的过程中,不能够简单将沉淀抛弃处理。
参考文献:
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