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       【关键词】  响应面；,,野菊花；,,黄酮
       摘要：目的优化野菊花总黄酮提取工艺。方法在分析单因素的基础上，以总黄酮得率为响应值，采用响应面实验设计方法（RSD）对其提取工艺进行研究。结果最佳工艺参数为乙醇浓度56.6%，提取温度80℃，液固比为19.6，提取时间为3.2 h，提取1次，该工艺条件可使总黄酮得率达4.64%。结论  该工艺条件可为工业生产提供参考数据。响应面试验设计法可在连续范围内进行分析，优于现在普遍采用的只能分析离散条件的正交实验设计。
       关键词：响应面；  野菊花；  黄酮
       The Optimal Extracting Conditions for Chrysanthemum Indicum L. by Response Surface Design(RSD)
       WANG ZhenZhong, WU WenJie
       （College of Marine Science and Engineering, Tianjin University of Science & Technology,  Tianjin 300222，China）
       Abstract：ObjectiveTo examine the procedure for the chemical extraction of the flavonoids in Chrysanthemum indicum L. MethodsThe procedure for the extraction was performed with the recovery yield of flavonoids as the response. Response surface design(RSD) was applied to find the optimum parameters ,which is based on onefactor experiment. ResultsIt was found that the procedure could achieve a good result when the sample was infiltrated with 19.6fold 56.6% ethanolwater solution and mixed around at 80℃ for 3.2 h. The recovery yield of flavonoids got to 4.64% once extraction. ConclusionThe procedure of the extraction can be helpful to the factoryscale production.
       Key words：Response surface;   Chrysanthemum indicum L.;   Flavonoids
   
　　野菊花［1］为菊科植物野菊Chrysanthemum indicum L.北野菊C．boreale Mak．或岩香菊C.javandulaefolium (Fish)Mak.的头状花序。秋冬二季花初开放时采摘，晒干或蒸后晒干入药，性凉，味苦、辛，归肺肝经，具有疏风清热、消肿解毒的功效，是一种临床历史长达上千年的常用中药。应用现代中药化学的分析手段发现在野菊花中蕴含着丰富的生物类黄酮化合物，体现出野菊花在降血压，改善心血管循环，清除超氧阴离子自由基抗衰老，防护紫外线等方面的功效。为了科学、充分地利用野菊花的黄酮资源，采用响应面试验设计方法（RSD）对影响总黄酮得率的关键因素进行条件优化，给大批量生产提供参考数据。响应面试验设计方法RSD［2］是利用合理的试验设计并通过实验得到的一定数据,采用多元二次回归方程来拟合因素与响应值之间的函数关系，通过对回归方程的分析来寻求最优工艺参数，解决多变量问题的一种统计方法。随着计算机的发展,它已成为精度高、应用广并具有实用价值的优化技术。
       　　1  仪器与试剂
       1.1  仪器756PC型可见-紫外分光光度仪: 上海光谱仪器有限公司， FA2004N电子天平: 上海精密科学仪器有限公司。
       1.2  试剂与样品芦丁对照品，购自中国（天津）药品生物制品检定所；野菊花中药饮片购自天津君福大药房（产地为河北，经中医医师张淑英确认为中药野菊花正品）其它试剂均为分析纯。
       　2  方法
       2.1  定量原理［3］根据《中国药典》（2000年版）及当前普遍采用的“NaNO2AlNO3NaOH”体系。
       2.2  标准曲线的制定
       2.2.1  对照品试液的配制称量105℃下烘干至恒重的芦丁对照品0.062 0 g，用适量95%乙醇充分溶解，放冷，转移至100  ml容量瓶中，用95%乙醇定容至刻度，摇匀做为对照品储备试液。此试液中芦丁浓度为0.62 g/L。
       2.2.2  标准曲线的绘制精密量取对照品试液0.0，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 ml，分别置于25 ml量瓶中，各加95％乙醇至6 ml，加5%亚硝酸钠溶液1 ml，使混匀，放置6 min。加10%硝酸铝溶液1 ml，摇匀，放置6 min。加5%氢氧化钠溶液5 ml，用95％乙醇定容至刻度，摇匀，静置。15 min后测试500 nm下的吸光度值，以不含芦丁的空白溶液为参比。将所得吸光度值与浓度的关系列于表1。
       表1  芦丁标准液浓度与吸光度值（略）
       应用最小二乘法将表1中的芦丁标准液浓度与吸光度值做一元线性回归分析，由Microsoft Excel获得回归曲线。结果见图1。
       图1   芦丁吸光度与浓度标准曲线（略）
       　3  影响黄酮得率的单因素考虑
       3.1  乙醇浓度的确定每次称取15 g野菊花粗粉，在80 ℃ ，料液比1∶20，浸提2 h，浸提一次的条件下，依次以质量分数为30%~100%的乙醇进行浸提，冰水浴快速冷却后抽滤。取10 ml续滤液用提取时的乙醇溶液定容至50 ml。量取3 ml显色后定容至25 ml，在500 nm下测得的吸光度与乙醇浓度的关系见图2。从图2可以看出，在乙醇浓度为50%～70%内对应吸光度值有个小平台。这种现象反映出野菊花中所含的生物黄酮类化合物具有黄酮苷元和糖苷两种形式，随着乙醇浓度的降低，前者的溶出量相对减少，后者则相对增加，中等浓度的乙醇溶液对两者的溶出率较适当。因此选择乙醇浓度范围50%～70%。
       图2  乙醇浓度对黄酮得率影响（略）
       3.2  液固比的确定分别称取10 ，12 ，15，20，30 g野菊花粗粉加入300 ml 50%乙醇溶液，在80℃下反应2 h。冰水浴快速冷却后抽滤各取续滤液10 ml 用50%乙醇溶液定容至50 ml 。分别取6，5，4，3，2 ml显色后测定500 nm下的吸光度值。液固比与吸光度值的关系见图3。从图3可以看出，随着液固比的不断加大，生物类黄酮化合物的溶出率也显著加大。当液固比在20倍后，黄酮化合物的溶出率增长缓慢。故选择液固比在15～25。
       图3  料液比对黄酮得率影响（略）
       3.3  温度的确定分别称取15 g野菊花粗粉加入300 ml50%乙醇溶液，在40～100℃范围内每隔10 ℃为一个测试点，反应2 h。冰水浴快速冷却后抽滤，取10 ml续滤液用50%乙醇溶液定容至50 ml。量取3 ml显色后在500 nm下测得的吸光度与反应温度的关系见图4。从图中可以看到，在低于80℃的范围内随着温度的逐渐升高黄酮得率随之升高，说明较高的温度对黄酮类化合物的溶出是有利的。当超过80℃后，黄酮得率变化不大。另考虑到超过乙醇沸点后溶剂挥发严重，故实际操作选取60～80℃。
       图4  温度对黄酮得率影响（略）
       3.4  反应时间的确定分别称取15 g野菊花粗粉加入300 ml 50%乙醇溶液，在80 ℃下反应1～6 h，以每1小时为一个测试点。冰水浴快速冷却后抽滤取10 ml续滤液用50%乙醇溶液定容至50 ml。量取3 ml显色后在500 nm下测得的吸光度与反应温度的关系见图5。从图中可以看出，当液固比较大时，黄酮的溶出比较快，2 h后的黄酮得率基本变化不大。故选择时间范围为2～4 h。
       图5  提取时间对黄酮得率影响（略）
       　4  响应面试验设计方法（RSD）
       对工艺参数的优化根据溶剂浓度、液固比、温度、提取时间4个单因素试验所确定的水平范围，以在食品生物学及工程学中广泛应用的Design-Expert Software 7.0为辅助手段设计响应面试验。选用了中心复合模型（CCD），做四因素三水平共30个实验点(6个中心点)的响应面分析实验。这30个实验点可分为两类：其一是析因点，自变量取值在各因素所构成的三维顶点，共有24个析因点；其二是零点，为区域的中心点，零点实验重复6次，用以估计实验误差。野菊花总黄酮得率为响应值(指标值)。为了处理数据的方便，各因素水平要化为标准函数。水平变换公式列于下。表2为响应面实验因素水平表。表3为响应面实验数据表。乙醇浓度： A＝A－60     10液固比： B＝B－20     5温度：  C＝C－70     10时间： D＝D－20*  A、B、C 、D均为实际水平，A、B、C、D则为参与分析的逻辑水平。
       表2  响应面实验因素水平（略）
       表3  响应面实验数据（略）
       经软件对表3中实验数据分析后发现用二阶多项式回归模型较优。以黄酮得率为响应值的回归模型如表4。
       表4  回归模型系数表（略）
       表5  方差分析（略）
       “Prob＞F”值如果小于0.05，说明对应的因素对响应值影响显著。表5为方差分析表，从表中可知在本实验设定的区域范围内(见表2)，乙醇浓度、水浴温度、时间与乙醇浓度的交互作用、时间与温度的交互作用、温度与液固比的交互作用(它们的“Pro＞F”值分别为0.008 6，＜0.000 1，0.007 7，0.046 3，0.046 3)对野菊花黄酮的得率影响显著。从上述回归模型中求最优后所得条件列于表6。
       图6  时间与浓度交互作用对黄酮得率影响应面（略）
       图7  时间与浓度交互作用对黄酮得率影响等高线（略）
       表6  预测最优条件（略）
       预测黄酮得率最大值4.657 9%。表7是验证预测最佳条件的实际操作。由表7可见实际与预测的黄酮得率较为接近。
       表7  最佳工艺条件的验证（略）
       　5  结论
       响应面分析法由Box及其合作者于20世纪50年代提出并逐步完善,它以回归方程作为函数估算的工具,将多因子试验中因素与试验结果的关系用多项式拟合,将因子与实验结果的关系函数化,因此,可对函数的面进行分析,研究因子与响应值之间、因子与因子之间的相互关系,并进行优化。它克服了正交实验只能给出最佳因素水平组合,而无法找出整个区域上因素的最佳组合和响应值的最优值的缺陷。目前,对植物中黄酮的提取条件研究多采用正交设计法,但正交设计只能处理离散的水平值,在实际应用中难免会有诸多局限性。本研究考察了野菊花黄酮的提取, 通过单因素实验考察了提取时间，乙醇浓度、水浴温度、液固比对野菊花黄酮得率的影响，应用响应面设计法优化出其最佳提取乙醇浓度56.6％，提取时间3.2 h，液固比19.6，水浴温度80℃，1次提取，为工业化利用丰富的野菊花资源，提取总黄酮提供了生产数据。
       　参考文献：
       ［1］  江苏新医学院.中药大辞典［M］.上海：上海科学技术出版社，1985：144.
       ［2］  Douglas C. Montgomery.汪仁官，陈荣昭（译）.Design and Analysis of Experiments［S］.北京：中国统计出版社，1998：591.
       ［3］  中华人民共和国卫生部药典委员会.中国药典，Ⅰ部［S］.北京：化学工业出版社，2000：563.
       (天津科技大学海洋科学与工程学院，天津  300222)