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       【摘要】 
       目的建立云南红豆杉枝叶中总黄酮含量的测定方法。方法采用紫外分光光度法，检测波长为272 nm。结果总黄酮检测浓度在12～28 μg/ml（r=0.999 2）范围内与吸光度线性关系良好，平均加样回收率为96.04%，RSD为2.7%。结论该方法用于云南红豆杉枝叶中总黄酮的含量测定，方法稳定，结果准确、可靠。
       【关键词】  紫外分光光度法； 红豆杉； 总黄酮
       Determination of Total Flavonoids in Branches and Leaves of Taxus Yunnanensis by Ultraviolet Spectrophotometry
       KONG Fansheng，YAN Chunyan*，BI Yongguang，LI Kunping，LUO Jiabo
       (Guangdong Pharmacological University，Guangzhou 510006，China； Key Laboratory of Chinese Drugs，South Medical University，Guangzhou 510515，China)
       Abstract:ObjectiveTo establish a method for the determination of total flavonoids in branches and leaves of Taxus yunnanensis．MethodsThe assay was performed by spectrophotometric method with a wavelength at 272 nm．ResultsThe linear detection concentration range of total flavonoids was in the range of 12～28 μg/ml（r = 0.999 2），average recovery was 96.04%，RSD=2.7%．ConclusionThe method is accurate，reliable and stable and it can be used for the determination of total flavonoids in branches and leaves of Taxus Yunnanensis.
       Key words:Ultraviolet spectrophotometry；  Taxus；  Total flavonoids
       
       红豆杉(Taxus)属裸子植物紫杉纲红豆杉科(Taxaceae)的常绿乔木，共11种，分布于北半球，我国有4种和1个变种［1］。紫杉属植物中含有的主要抗癌活性成分是以紫杉醇为主的二萜类化合物。随着研究的不断深入，黄酮类化合物也显示出了良好的抗癌效果［2，3］。据报道，红豆杉中也有着多种黄酮类成分［4，5］，故研究红豆杉中的黄酮类成分对保护稀有树种红豆杉，提高其资源利用率有着积极意义，但有关红豆杉总黄酮含量测定目前尚未见准确报道。本研究用紫外分光光度法对红豆杉中的总黄酮进行测定，并进行了方法学的考察，以期为红豆杉中黄酮类化合物的开发和利用提供科学依据。
       1  仪器与试药
       
       Agilent 1100高效液相色谱仪；HP UV-8453型可见紫外分光光度计；Sartorius Cp3245型天平；KQ-500DE型医用数控超声仪；DHG-9140A电热恒温鼓风干燥箱；LABOROTA 4000旋转蒸发仪，LG 10-2.4A离心机。
       
       金松双黄酮对照品（自制，HPLC纯度>95%）；甲醇为色谱纯。其余试剂均为分析纯。药材为云南红豆杉（Taxus yunnanensis Cheng et L.K.Fu）的枝叶采自云南大理云龙县，经南方医科大学生药学教研室鉴定。
       2  方法与结果
       2.1  对照品溶液的配制  金松双黄酮为红豆杉中生理活性较好的黄酮类成分，故以此作为总黄酮测定中的对照品较具有代表性。精密称取干燥至恒重的金松双黄酮2 mg，置50 ml容量瓶中，加甲醇30 ml，超声振荡使溶解，放冷至室温，甲醇定容至刻度，摇匀，得浓度为40 μg/ml的对照品储备液。
       2.2  供试品溶液的配制  准确称取红豆杉药材粉末1 g，加石油醚25 ml，超声提取30 min，抽滤，重复提取1次, 滤液弃去。药渣挥干石油醚残液, 加甲醇25 ml，超声提取30 min，抽滤，重复两次，滤液合并浓缩, 置10 ml容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀。
       2.3  最大吸收波长的选择取对照品溶液和提取溶液进行波长扫描（图1～2），对照品与供试品溶液在272 nm附近处吸收较强，故选择272 nm作为测定波长。
       图1  对照品紫外扫描光谱（略）
       图2  提取液紫外扫描光谱（略）
       2.4  标准曲线的绘制  精密量取金松双黄酮对照品溶液0.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0 ml, 分别置于10 ml容量瓶中，甲醇定容至刻度。用紫外-可见分光光度计于272 nm处测定吸光度值, 以吸光度(A)对浓度(C)进行线性回归，得回归方程：
       
       C=1.55+29.16A，r=0.999 2，在12～28 μg/ml范围内线性关系良好。
       2.5  精密度实验  取金松双黄酮对照品溶液5 ml 5份，在272 nm处测吸光度，吸光度平均值为0.576 6，RSD为0.82%，表明该仪器精密度良好。
       2.6  重复性实验  精密称取药材样品1 g 共5份，按照“2.2”项下条件平行实验,依法处理，在272 nm处测定吸光度。结果，平均含量为5.14%，RSD=2.08%。结果表明，本方法重现性良好。
       2.7  加样回收率实验  称取已知含量的药材约0.2 g共5份，于60℃干燥至恒重，精密称重，置50 ml磨口锥形瓶中，加入金松双黄酮对照品10 mg，按照“2.2”项依法处理，测定272 nm处吸光值，以相应试剂为空白，按对照品的回归方程进行计算处理，回收率平均值为96.04%，RSD为2.7%。结果见表1。
       表1  加样回收率实验结果 （略）
       2.8  稳定性实验  取“2.5”项下5号样品，于0，10，30，60，90，120 min，测定吸光值，平均值为0.575 8，RSD为3.03%，表明样品在120 min内稳定性良好。
       2.9  测定结果  取3个编号的红豆杉样品各3份，分别按“2.2”项下的方法配制成供试品溶液，再各准确吸取0.3 ml于25 ml容量瓶中，甲醇定容至刻度，摇匀，272 nm测定其中总黄酮含量。结果见表2。
       表2  样品含量测定结果 （略）
       3  讨论
       3.1  样品前处理方法选择  为了准确测定样品，故对提取方法及提取时间分别进行了考察。实验结果表明，在所考察的回流提取法、超声提取法、连续回流提取法中,采用超声提取法对有效成分的提取效果最优。
       3.2  对照品的选择  经文献检索，至今没有发现测定云南红豆杉总黄酮含量的报道，在以前的实验工作中，曾经以芦丁作为测定总黄酮的对照品，芦丁的最大吸收波长在500 nm左右，但红豆杉中没有发现有芦丁成分的报道。经测定云南红豆杉样品的最大吸收波长在272 nm处，而金松双黄酮在272 nm处也有最大吸收波长，故选择内源性化合物金松双黄酮作为测定云南红豆杉总黄酮的对照品更为合理。
       3.3  样品的选择 红豆杉中有多种抗癌成分，其中以紫杉醇为主的二萜类成分效果最为显著，云南红豆杉是红豆杉树种中含紫杉醇等抗癌成分比较高的树种，但含量也仅ppm级的含量［6］，且红豆杉的生长速度特别缓慢，资源较少，故用可再生的枝叶作为材料，在提取紫杉醇为主的抗癌活性成分的同时也开发如黄酮类等有效成分，这样既可以保护资源，又提高了资源的利用率，甚至开发出的新产品可以降低紫杉醇的昂贵价格及使用时的不良反应，这有待同行的共同努力。
       
       本实验方法操作简单易行，结果准确可靠，为红豆杉中黄酮类化合物的开发利用提供了科学依据。
       【参考文献】
         　　［1］ 吴榜华，孙广仁，张启昌. 紫杉属树木培育技术及紫杉醇的开发利用问题［J］.吉林林学院学报，1999，2(10):199.
       
       ［2］ Kawaii S,Tomono Y,Katase E,et al.Bioscience Biotechnology and Biochemistry［J］.1999,63(5):896.
       
       ［3］ 马 波，李梦龙，周在德，等. 黄酮体化合物抗肿瘤活性的量子化学研究［J］.化学研究与应用, 2002,14(2):149.
       
       ［4］ 官 智，苏镜娱，曾陇梅，等. 红豆杉中的非紫杉烷类化合物［J］.热带亚热带植物学报，2000, 8(2)：182.
       
       ［5］ 徐彩霞，梁敬钰.美丽红豆杉的化学研究进展［J］.海峡药学，2003，15（2）：3.
       
       ［6］ 王达明，周 云，张裕农，等.不同生长类型云南红豆杉林木枝叶的紫杉烷含量测定［J］.西部林业科学，2007，26（3）30.