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       【摘要】 
       
       摘要：目的优选文山野生金线莲种质资源。方法通过测定不同种金线莲中的总黄酮及多糖含量，并以总黄酮及多糖含量为指标，筛选优质金线莲种质资源。结果6个野生金线莲样品中总黄酮含量基本相同，多糖含量相差较大，其中2号金线莲（花叶开唇兰Anocetochilus roxburghii，叶片无明显叶脉的“金线莲公”）总黄酮含量最高，为43.01(mg/g DW);4号野生金线莲（滇越金线兰Anocetochilus chapaensis）多糖含量最高为112.40 (mg/g DW)。结论花叶开唇兰A. roxburghii及滇越金线兰A. chapaensis是文山野生金线莲中的优良种质资源。
       【关键词】  金线莲 总黄酮 多糖
       Determination of Total Flavonoids and Polysaccharide of the Wild Anocetochilus Plants in Wenshan Prefecture
       ZHANG Zhixin， ZHANG Tie， ZHAO Baofa， HU Guohai， ZHANG Shixiu
       Department of  Biochemistry, Wenshan Normal College, Wenshan, Yunnan 663000, China
       
       Abstract：ObjectiveTo select the optimal germplasm resource from the Wild Anocetochilus plants in Wenshan.MethodsIn order to get the high quality idioplasm resources of Anocetochilus which have higher total flavonoids and the polysaccharide contents, the contents of total flavonoid and the ploysaccharide were determined in different Anocetochilus. plants.ResultsTotal flavonoids contents were basically the same, and the polysaccharide content difference was big in 6 wild A. roxbarghii samples. The highest content of total flavonoids was 43.01 (mg/g DW) in 2# sample, and the highest content of plolysaccharide was 112.40 (mg/g DW) in 4# sample.ConclusionA. roxburghii and A. chapaensis are fine germplasms in Wenshan wild Anocetochilus.
       Key words：Anocetochilus;  Total flavonoids；  Polysaccharide
       金线莲为兰科开唇兰属植物花叶开唇兰Anoectochilus roxburghii(Wall.)Lindl的全草, 是一种多年生珍稀名贵的中草药。我国南方广西、广东、贵州、四川、云南等省都有其丰富的药材资源，民间素有“药王”“金草”之美誉，主要用于治疗高血压病、糖尿病、心脏病、肺炎、急性肝炎、肾炎、肿瘤等病症［1］。通过药理研究，其中的活性多糖和总黄酮被推测为该药材中的主要活性成分［2］。通过调查，文山野生金线莲分布于文山、砚山、西畴、马关和麻栗坡，但由于人为破坏，现今主要分布于文山东南部的西畴、马关和麻栗坡的原始森林中［3］，为了合理地开发金线莲资源，可进行组培快繁和人工栽培，解决市场需求。而通过组织快繁金线莲，种质资源选择是关键，因此对当地野生金线莲中的主要活性成分总黄酮和多糖的测定具有一定的现实意义。在文山收集的野生金线莲中，依据其叶片上的性状不同，从植株性状可分为3种，1种具有金黄色网状叶脉，民间称为“金线莲母”的类群；第2种是网状叶脉和叶脉不明显的“金线莲公”；第3种是叶片呈绿色，叶脉为白线的类群。
       1  材料与仪器
       1.1 仪器
       UV-2550紫外分光光度计（日本岛津）；AEL-40SM十万分之一天平（日本岛津）；干燥箱CS-101-2CS（重庆实验仪器厂）；KQ2200E医用超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），HH-2数显恒温水浴锅（国华电器有限公司）。
       1.2 试剂
       芦丁对照品购于中国药品生物制品检定所；葡萄糖、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠均为分析纯。
       1.3 药材
       1～8号金线莲全株于2007-10分别采集，经文山师范高等专科学校生化系沐建华讲师鉴定无误（见表1），样品洗净，于80℃干燥至恒重，粉碎（过60目筛）备用。表1  开唇兰属植物样品（略）
       2 方法
       2.1 总黄酮及多糖的提取流程
       称取金线莲材料1 g，用滤纸包好置于脂肪抽提器中，用甲醇200 ml作溶剂提取，回流提取到提取液接近无色，停止回流，收集甲醇提取液，用甲醇定容至200 ml进行总黄酮含量测定；把残渣转到锥形瓶中，用选择好的提取工艺进行提取，得到提取液，用蒸馏水定容至800 ml进行多糖含量测定。
       2.2 总黄酮测定方法
       2.2.1 标准曲线的制作［4］
       精密称取120℃干燥至恒重的芦丁对照品10 mg用20 ml乙醇溶解后，转移到100 ml容量瓶中，加水至刻度，摇匀即得（溶液中含无水芦丁的含量为0.1 mg/ml）。精密吸取芦丁标准液0.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0，12.0 ml。分别置于50 ml容量瓶中，各加水至12 ml，加5%NaNO2溶液2 ml，混匀，放置6 min，加10%Al(NO3)3溶液2 ml，混匀，放置6 min,加4%NaOH 20 ml,再加水至50 ml，放置15 min，以不加芦丁对照品的试剂作空白对照。按分光光度法在503 nm（全波长扫描，在503 nm处有最大吸收）波长处测定吸光度。以所取标准液含有的芦丁标样量mg数和吸光度数据经回归处理，得到回归方程：Y=0.219 6X-0.011 2，相关系数r=0.999 3。
       2.2.2 总黄酮含量计算方法
       精密吸取1.0 ml多糖提取液，按“2.2.1”项下内容操作，再根据下列公式计算，测定结果。
       样品中的总黄酮含量（以芦丁计）：  
        
       总黄酮含量（mg/gDW）=200CW
       式中：C为1 ml样品液含黄酮量(mg)，W为金线莲样品质量(g)。
       2.3 多糖测定方法［5］
       2.3.1 标准曲线的制作
       精密称取105°C干燥至恒重的无水葡萄糖标准品25 mg，置于250 ml容量瓶中，加蒸馏水至刻度，配成0.1 mg/ml的标准溶液。分别移取上述标准溶液0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0 ml，依次加水使最终体积为1.0ml，另取1.0 ml蒸馏水作为空白。每一试管中加入1.0 ml 5%苯酚溶液，混匀，迅速加入5.0 ml浓硫酸，振摇5 min后放置35 min，在最大吸收波长490 nm处测定吸光度，得回归方程：A=5.882 4C-0.000 3，r=0.995 4。其中A为吸光度，C为葡萄糖浓度（mg/ml）。
       2.3.2 多糖含量计算方法
       精密吸取1.0 ml多糖提取液，按“2.3.1”项下内容操作，再根据下列公式计算，测定结果。
       样品中的多糖含量（以葡萄糖计）：
       多糖含量（mg/gDW）=800CW
       式中：C为1 ml样品液含多糖量(mg)，W为金线莲样品质量(g)。
       2.3.3 芦丁回收率的测定
       准确称取3号金线莲样品甲醇提取液取20 ml共3份，分别加入一定量的芦丁对照品，按“2.2.2”项下操作。用紫外分光光度计测定吸光度，得出总黄酮含量，根据回收率公式计算出回收率。
       
       回收率（%）=（混合后测得总黄酮含量-样品中总黄酮含量）芦丁对照品加入量×100%
       2.3.4 总黄酮测定
       精密度实验精密吸取3号金线莲样品甲醇提取液1 ml，共6份，按“2.2.2”测定。
       2.3.5 葡萄糖回收率的测定
       经过“2.3.3”处理后的残渣用水作溶剂进行提取，得到的提取液取20 ml共3份，分别加入一定量的葡萄糖对照品，按“2.3.2”项下方法操作。用紫外分光光度计测定吸光度，得出多糖含量，根据回收率公式计算出回收率。
       回收率（%）=（混合后测得总黄酮含量-样品中总黄酮含量）葡萄糖对照品加入量×100%
       2.3.6 多糖测定
       精密度实验经过“2.3.4”处理后的残渣，进行水提，得到的提取液定容至800 ml，精密吸取1 ml，共6份，按“2.3.2”项下方法测定。
       3  结果与讨论
       3.1 超声作用时间对多糖提取率的影响
       为了探讨超声作用时间对金线莲多糖提取效果的影响，取1g 3号野生金线莲样品，加入40 ml蒸馏水，水浴温度70℃，采用不同超声时间提取2次，按“2.3”项下测定多糖含量。结果见表2。表2  超声作用时间对多糖提取率的影响（略）
       由表2可以看出，随着超声时间的增加，提取率不断提高，当超声40 min时，金线莲多糖的提取率最高，继续超声则多糖的提取率呈现下降趋势，这可能是由于超声时间过长，导致溶剂挥发而造成的，故根据实验结果选择每次超声作用时间为40 min。
       3.2 提取温度对多糖提取率的影响
       为了探讨温度对金线莲（3号）多糖提取效果的影响，在其它条件相同的情况下，仅改变超声提取水浴温度，按“2.3”项下测定多糖含量。结果见表3。表3  提取温度对多糖提取率的影响（略）
       由表3可以看出，随着超声提取水浴温度的上升，金线莲多糖的提取率呈现上升趋势，但当超声提取水浴温度超过70℃，溶剂的挥发量急剧加快，导致提取率下降，根据实验结果确定超声提取水浴温度为70℃。
       3.3 液料比对多糖提取率的影响
       为了探讨液料比对金线莲（3号）多糖提取效果的影响，在其它条件相同的情况下，仅改变水和金线莲的体积质量比。结果见表4。表4  液料比对多糖提取率的影响（略）
       由表4可以看出，当液料比为30∶1时，多糖的提取率最高。液料比太小，溶剂不足以溶解足够多的溶质；而液料比太大，会增加超声波破碎细胞的阻力，使细胞破碎程度下降，从而降低多糖的提取率。综上所述，根据实验结果，选择液料比为40 ∶1。
       3.4 超声提取次数对多糖提取率的影响
       为了探讨超声作用次数对金线莲多糖提取效果的影响，取1 g金线莲（3号）样品，加入40 ml蒸馏水，水浴温度70℃，每次超声时间40 min，分别提取1，2，3，4次，按“2.3”项下测定多糖含量。其实验结果见表5。表5  超声提取次数对多糖提取率的影响（略）
       从表5可以看出，随着提取次数的增加，多糖的提取率呈现增加趋势，对样品提取3次，金线莲中的多糖基本提取完全，故本实验选择超声提取3次。
       3.5  芦丁回收率实验样品回收率实验结果见表6。由表6可以看出本实验的平均回收率为99.72%，相对标准偏差（RSD%）为1.858。表6  芦丁回收率实验结果（略）
       3.6  总黄酮测定精密度实验精密度实验结果见表7。从表7可以看出，相对标准偏差为0.609 3%，结果显示重复性较好，精密度较高。表7  总黄酮精密度实验结果（略）
       3.7  葡萄糖回收率实验结果见表8。由表8可以看出本实验的平均回收率为101.757%，相对标准偏差（RSD%）为0.487。表8  葡萄糖回收率实验结果（略）
       3.8  多糖测定精密度实验结果见表9。从表9可以看出，相对标准偏差（RSD%）为0.540 2，结果显示重复性较好，精密度较高。表9  多糖测定精密度试验结果（略）
       3.9 文山野生金线莲中总黄酮及多糖含量
       分别精密称取不同品种的金线莲1 g，按“2.1”项下方法提取总黄酮及多糖，多糖提取采用以蒸馏水为溶剂，液料比（ml∶g）40 ∶1，提取水浴温度为70℃，每次超声时间40 min，提取3次，按“2.2”及“2.3”项下方法分别测定金线莲样品中的总黄酮及多糖含量。实验结果见表10～11。
        从表10～11中可以看出，不同类群的金线莲中总黄酮的含量相差不是很悬殊，但多糖的含量相差很大，故选择野生金线莲作为组培材料时，以多糖含量高者为优，故进行组织培养时，应该选择4，5号野生金线莲(即滇越金线兰A . chapaensis或西南齿唇兰A . moulmeinensis)作为组培材料。表10  不同品种金线莲总黄酮的含量测定（略）表11  不同品种金线莲多糖的含量测定（略）
       4 结论
       本实验确定了一套金线莲总黄酮及多糖的测定工艺，实验得出最佳的测定工艺为：首先以甲醇为溶剂，用脂肪抽提器对金线莲中的总黄酮进行提取，然后再用此残渣在超声条件下，采用以蒸馏水为溶剂，液料比（ml∶g）40 ∶1，提取水浴温度为70℃，每次超声时间40 min，提取3次的工艺进行多糖含量的测定。
       采用此测定工艺，可以使用一份金线莲样品测定总黄酮及多糖两类活性成分，并使两类成分在含量测定时不互相干扰，从而使测定结果能更好地反映其真实含量。本实验采用的方法简单易行，结果可靠。
       
       通过对文山野生金线莲中总黄酮和多糖含量的测定，6个野生样品中总黄酮的含量悬殊不大，2号金线莲（花叶开唇兰A.roxburghii，叶片无明显叶脉的“金线莲公”）总黄酮含量最高，为43.01 mg/g DW；多糖含量相差较大，4号野生金线莲（滇越金线兰A . chapaensis）多糖含量最高为112.40 mg/g DW。本课题组以1号野生金线莲（花叶开唇兰A.roxburghii，叶片具金黄色叶脉的“金线莲母”）作为组培材料，通过组培、移栽8个月，对其中的总黄酮和多糖进行测定，总黄酮含量为36.27 mg/g DW，多糖含量为99.92 mg/g DW。这一结果表明，对1号野生金线莲的组培、种植技术条件控制比较理想，以此为基础，进一步对4，5号野生金线莲（即滇越金线兰A . chapaensis或西南齿唇兰A . moulmeinensis)的组织培养、种植技术进行研究。
       【参考文献】
         　　［1］张以忠，邓琳琼，黄丽华，等.金线莲研究的现状与展望［J］.贵州科学，2007，25（2）：81.
       
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       ［3］张铁，万京，沐建华.文山地区金线莲种质资源初步调查［J］.文山师范高等专科学校学报，2005，18（1）：26.
       
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       ［5］刘晔玮，邸多隆，葛 斌，等.锁阳多糖提取工艺研究［J］.天然产物研究与开发，2006，18（6）：1007.