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       【摘要】 
       目的探讨夜香树花提取物对体外培养的肿瘤细胞株生长抑制的影响。方法按极性递增原则回流提取得到夜香树花提取物总浸膏和正丁醇部位，再采用MTT法和集落形成法观察夜香树花提取物总浸膏和正丁醇部位对人胃癌细胞株SGC7901、人肝癌细胞株Bele7404、宫颈癌细胞株Hela的生长抑制情况。结果当夜香树花总浸膏浓度为40μg/ml及正丁醇部位提取物浓度为20 μg/ml时对3种肿瘤细胞株的生长抑制率为48.10%～68.97%。结论 夜香树花提取物在体外具有明显抗肿瘤作用。
       【关键词】  夜香树花; 总浸膏; 正丁醇部位; MTT法; 集落形成法
       夜香树(Cestrum nocturnum Linn，CN)，为茄科夜香树属植物，其花色黄绿或洁白，白昼闭合无香气，夜晚开放且香气浓郁，香味可驱蚊。对CN叶进行体外抗肿瘤实验研究结果表明，CN叶提取物具有抗肿瘤作用，并且证明了有效成分主要集中在正丁醇部位[1]。为了探讨其花是否也具有抗癌作用，本实验对CN花提取物进行体外抗肿瘤研究。现将研究结果报道如下。
       1 材料与仪器
       1.1 药物CN花采自广西境内，经本学院药用植物教研室刘寿养教授鉴定为茄科属植物夜香树(Cestrum nocturnum Linn.);长春新碱(陕西博森生物制药，批号：20050917)。
       1.2 肿瘤细胞株 人胃癌细胞株SGC7901和宫颈癌细胞株Hela购自上海细胞生物研究所细胞库，人肝癌细胞株Hele7404由广西医科大学药理教研室提供。
       1.3 试剂MTT(四甲基噻唑蓝)德国Sigma公司产品，批号：050609;FBS(胚胎牛血清)杭州四季青生物工程材料有限公司产品，批号：060226;RPMI1640培养基，美国GIBCO公司产品，批号：1120708;Trypsin(胰蛋白酶)天津市景洋生物制品有限责任公司产品，批号：00503;DMSO(二甲基亚砜)上海润捷化学试剂有限公司产品，批号：20051026。
       1.4 仪器CO2培养箱(ThermO Forma)美国产;倒置显微镜(Olympus)，日本产;酶标仪(Biocell)，奥地利产;培养瓶(美国Promega Corporation产);96孔板(德国产，型号：3679);培养皿(美国产，型号：3001);微量加样器(日本产，型号：Nichipet)。
       2 方法
       2.1 提取物的制备[2]CN花晒干后，用乙醇提取浓缩得总浸膏后再用正丁醇回流提取，得到正丁醇部位。
       2.2 MTT法测定[3，4]取对数生长期的肿瘤细胞，用含10%小牛血清的RPMI-1640培养液调配成浓度为5 000个/ml，接种于96孔板，每孔加入200 μl，其中包括190 μl肿瘤细胞悬浮液和10 μl药液，试药按浓度递增原则各设5个不同的浓度，终浓度分别为5，10，20，40，80 μg/ml，每种药的每种浓度均设3个平行孔，空白阴性对照组为等容积的RPMI-1640培养基。在37℃、10%CO2条件下培养3 d。弃去上清液后，每孔加入200 μl浓度为0.2 mg/ml的MTT溶液(用1640培养基配制)，振荡混匀后继续培养4 h。再弃去上清液，每孔加入200 μl DMSO溶液，轻轻振荡使MTT甲臜沉淀溶解，用酶标仪(波长为550 nm，参比波长为450 nm)测定其OD值，计算抑制率，求IC50。按下列公式计算药物对肿瘤细胞增殖的抑制率。
       抑瘤率(%)=(1-实验组平均OD值/对照组平均OD值)×100﹪
       2.3 集落形成法[3，5]取对数生长期的肿瘤细胞，用0.5 ml、0.25%的胰蛋白酶消化，细胞计数后用含10%小牛血清的RPMI-1640培养液调配成浓度200个/ ml，接种于24孔板，每孔加入1 ml，其中包括950μl肿瘤细胞悬浮液和50 μl药液，药物的最终浓度为10 μg/ml，每种药每种浓度设4个平行孔，阴性对照组加入950 μl肿瘤细胞悬浮液和50 μl RPMI-1640培养基，摇匀后置37℃、10%CO2培养7d。弃去上清液，用瑞氏染液染色5 min，然后用Giemsa"s溶液与Sorensen磷钼酸缓冲液以1∶9混合，染色10 min。流水冲洗、凉干，在20×的显微镜下计数含50个细胞以上的集落，重复3次。按下式计算集落形成率及抑制率。
       集落形成率(%)=克隆数/接种细胞数×100%
       集落抑制率(%)=1-克隆数/对照组克隆数×100%
       2.4 统计学处理 以SPSS 10.0统计软件分析,两组间的均数比较采用t检验。
       3 结果
       3.1 MTT法 CN花不同提取物对SGC7901、Bele7404和Hela细胞株增殖的影响。结果见表1。表1 CN花不同提取物对肿瘤细胞增殖的抑制作用与空白对照组比较，*P<0.05，**P<0.01
       表1结果显示，总浸膏和正丁醇浸膏对3种肿瘤细胞株增殖均有抑制作用，抑制率与空白对照组比较有显著性差异，且抑制率与浓度成正比，其中正丁醇浸膏的抑制作用更为明显。总浸膏对SGC7901、Bele7404和Hela的IC50分别为28.10，49.82，27.70，而正丁醇浸膏的分别为18.44，19.00，19.49 μg/ml。
       3.2 集落形成法 CN花不同提取物对SGC7901、Bele7404和Hela细胞株集落形成的影响。结果见表2。
       表2结果显示，在浓度为10 μg/ml下，总浸膏和正丁醇浸膏对3种肿瘤细胞株的集落形成均有不同程度的抑制作同，与空白对照组比较(P<0.01)，都有显著性差异。
       4 讨论
       体外筛选抗肿瘤药物具有用药少、周期短、费用少等优势，且其筛选结果与体内实验的相关性好，因此已被一些研究机构作为常规的抗肿瘤药物初筛手段[6]。MTT法有灵敏度高、稳定性好、快速、操作简便、可评价率高、测定结果客观等优点[7]，近年来MTT法已取得丰硕成果，其方法学日臻完善，更接近临床，更具有实用价值，广泛用于化疗药物筛选和生物学及医学研究中[8]。而集落形成法能反映单个细胞的增殖能力，通过集落计数可对克隆原细胞作定量分析，能较灵敏地测定抗癌药的活性，目前被认为是一种较理想的检测方法[3]。表2 CN花不同提取物对肿瘤细胞集落形成的影响与空白对照组比较，*P<0.01;n=3
       实验首先对CN花提取物总浸膏和正丁醇浸膏进行MTT法实验，结果表明总浸膏和正丁醇浸膏对人胃癌细胞SGC7901、人肝癌细胞Bele7404和人宫颈癌细胞Hela的增殖均有抑制作用，且抑制作用呈明显的剂量关系，尤其正丁醇浸膏的作用明显。在浓度为80 μg/ml时，正丁醇浸膏的抑制率约在80%，并且对3种细胞的IC50均小于20 μg/ml，而总浸膏的IC50接近20 μg/ml，原因可能是总浸膏所含杂质多，也说明了CN花提取物的主要有效成分主要集中在正丁醇部位。按体外抗肿瘤疗效评价规定[9]：植物粗提物的IC50小于20 μg/ml时，则可断定药物在体外对肿瘤细胞有杀伤作用。通过集落形成法对实验进一步验证，结果也表明其总浸膏和正丁醇浸膏能抑制细胞集落的形成。
       CN花提取物在体外实验具有一定的抗肿瘤作用，但其抗瘤作用的真正机理、取物中究竟是何种成分在发挥作用以及体内是否具有抑瘤作用尚不明确，需深入进行研究。实验为对CN花进一步研究提供了一定的理论依据。
       【参考文献】
         　[1] 赵世元,钟振国,廖 文,等.夜香树提取物体外抗肿瘤作用的实验研究[J].天然产物研究与开发,2008, 20(1):125.
       
       [2] 盘永才.具有抗肿瘤活性的甾醇、萜类天然药物及其提取与分离方法[J].世界医药,2006,12(5):15.
       
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       [4] 钟振国,张凤芬,甄汉深,等.美味猕猴桃根提取物抗肿瘤作用的实验研究[J].中医药学刊,2004,22(9):1705.
       
       [5] 于春艳,李 薇,刘玉和,等.白花蛇舌草提取物体外抗肿瘤作用及机制研究[J].北华大学学报(自然科学版),2004,5(5):412.
       
       [6] 张均田.现代药理学实验方法学[M].北京:北京医科大学中国协和医科大学联合出版社,1998:818.
       
       [7] Awadak, yoneT, Ueokah, et al. com Parison of the mosensitivity test: clonogenic assay versus MTT assay[J].Acta Medokayam.2002, 56(3): 129.
       
       [8] 唐亚辉.人类肿瘤化疗药敏检测方法的研究现状[J].江西中医学院学报,2000,12(3):142.
       
       [9] 韩 锐.抗癌药物研究与实验技术，第1版[M].北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社, 1997：271.