文章标题 全文   多个检索词，请用空格间隔。

       【摘要】 
       目的以红车轴草总异黄酮为目的物，筛选最佳提取条件和吸附树脂。方法采用单因素和正交实验法筛选最佳提取工艺，采用静态吸附脱附法筛选最佳树脂。结果红车轴草总异黄酮最佳提取工艺为：提取温度为80℃，提取时间为1 h，料液比为1∶12，碱水pH为11，提取2次，树脂D103是有较好的吸附脱附效果。结论采用此法可较好地提取、富集、纯化红车轴草总黄酮。
       【关键词】  红车轴草; 总异黄酮; 正交实验; D103大孔树脂
       红车轴草Trifolium pratense L.为豆科多年生草本植物，现在我国已进行大面积栽培。文献报道其提取物具有抗肿瘤，治疗胃溃疡、胃癌、乳腺癌和骨质疏松症等作用[1]，其主要活性成分为异黄酮类化合物，如大豆素、染料木素和鹰嘴豆芽素等[1，2]，这些异黄酮化合物具有植物雌激素样作用，能够双向调节人体内的激素水平，当人体雌激素水平不足时，它与人体雌激素受体结合，产生弱雌激素作用，以弥补人体自身雌激素的不足;当人体雌激素水平过高时，它与人体雌激素受体结合，从而阻止人体自身所分泌的雌激素与受体结合，达到降低人体雌激素水平的目的，因而对妇女有关体内激素方面的疾病具有预防、保健和医疗作用[3]，其提取物广泛用作保健食品或功能食品的原料，因而备受人们关注。目前有关红车轴草的提取工艺主要以乙醇为提取溶剂，由于乙醇系有机溶剂，消耗大、成本高、且生产过程存在易燃等安全隐患，为此我们根据红车轴草异黄酮有一定的水溶性，改用水做提取溶剂，以总异黄酮为目标，对其总异黄酮进行了正交提取工艺研究，并对最佳提取工艺得到的提取液进行了大孔吸附树脂吸附分离性能研究，以期为红车轴草总异黄酮的开发利用提供依据。
       1 材料与仪器
       1.1 材料 红车轴草(采自乐山师范学院)的植物地上部分，除去杂草，60℃鼓风干燥7 h，粉碎。
       1.2 试剂鹰嘴豆芽素对照品(含量≥98%)：购自Sigma公司;大孔树脂D101，D102，D103，D104，购自天津市大钧科技开发有限公司。试剂为分析纯。
       1.3 仪器 电热恒温水浴锅(H·H·S21-6C，上海医疗器械五厂);电子分析天平(FC204，上海精科实业有限公司);UV -762紫外分光光度计(上海精密科学仪器有限公司);旋转蒸发器(上海亚蓉生化仪器厂);SHZ-D(Ⅲ)循环水式真空泵，索式提取器，电热鼓风干燥箱;植物粉碎机(FZ102，天津市泰斯特仪器有限公司)。
       2 方法
       2.1 总异黄酮的含量测定
       2.1.1 测定波长的选择将鹰嘴豆素对照品、红车轴草异黄酮提取液配成适当浓度，在200～400 nm波长范围内进行光谱扫描，二者吸收曲线类似，均在258 nm处有最大吸收，故选择285 nm为测定波长。
       2.1.2 对照品溶液的配置和标准曲线的制备精密称取干燥至恒重的鹰嘴豆芽素对照品4.0 mg，置于50 ml容量瓶中，加入95%的乙醇溶解，并定容至刻度，摇匀，即可。精密吸取0.0 ，0.3，0.6，0.9，1.2，1.8，2.4 ml标准液，分别置于10 ml容量瓶中，各自加入95%的乙醇1 ml，加蒸馏水定容，摇匀，在波长258.5 nm处测定吸收值。得回归方程为：C=0.009 68A+0.000 06， r=0.999 1, 结果表明，鹰嘴豆芽素对照品在2.4～19.2 μg/ml范围内，浓度与吸光度线性关系良好。
       2.1.3 样品的含量测定按照标准曲线的方法，以鹰嘴豆芽素为对照品测定样品的含量。
       2.2 红车轴草提取工艺效果的因素实验
       2.2.1 单因素实验准确称取0.30 g红车轴草粉末置于微型回流装置中，在不同条件下提取以确定提取因素变化范围以及各因素的较佳值。通过测定提取液中总异黄酮含量，计算总异黄酮的提取率，以判断最佳条件。
       2.2.2 正交工艺实验以水的pH、浸提温度、料液比和浸提时间4种因素作为参考对象，采用正交L9(34)，以获取最佳工艺参数。
       2.3 大孔树脂静态吸附实验
       2.3.1 饱和吸附量的测定准确称取经预处理的用滤纸吸干表面水分的树脂0.50 g于50 ml三角瓶中，精密加入1.06 mg/ml的红车轴草总异黄酮溶液10.0 ml，在25℃，180 r/min的条件下振荡吸附24 h。测定吸附后溶液中总异黄酮的量，并按下式计算树脂的饱和吸附量。饱和吸附量=(加入的总异黄酮-未吸附的总异黄酮)/ 树脂的量
       2.3.2 树脂脱附率的测定将上述经过24 h静态吸附总异黄酮的树脂分离出来，吸干表面水分，然后加入70%的乙醇5.0 ml，在25℃，180 r/min的条件下振荡脱附2 h。测定脱附液中总异黄酮的量，按下式计算脱附率。脱附率(%)=洗脱出的总异黄酮/(加入的总异黄酮-未吸附的总异黄酮)×100%
       3 结果
       3.1 单因素实验
       3.1.1 水液pH对提取效果的影响异黄酮含有酚羟基，呈酸性，故选用碱性水做提取液。在60℃温度下，1∶16的料液比，搅拌提取1h时，水液pH对总异黄酮的提取效果见图1。从图1可以看出选择pH为11的水液做提取溶剂是最合适的。
       3.1.2 温度对提取效果的影响固定碱水pH为11，料液比为1∶16，提取1次，提取时间为1 h，变化提取温度。温度对异黄酮提取效果见图2。图1 碱水pH对总异黄酮提取率的影响图2 温度对总异黄酮提取率的影响从图2可以看出随温度升高，总异黄酮的提取率增加，温度达到80～90℃时提取率差异不大，从成本和黄酮的热稳定性考虑，选择80℃左右的温度较佳。
       3.1.3 料液比对提取效果的影响固定碱水pH为11，提取温度为80℃，提取时间1 h，提取1次，改变料液比。不同料液比对总异黄酮提取效果见图3。图3 料液比对总异黄酮提取率的影响从图3可以看出料液比为1∶20时总异黄酮提取率最高，但与料液比1∶16时差别很小，考虑后续工艺处理成本，优选1∶16的料液比。
       3.1.4 提取时间对提取效果的影响固定碱水pH为11，提取温度为80℃，料液比为1∶16，提取1次，改变提取时间。不同提取时间对总异黄酮提取效果见图4。图4 时间对总异黄酮提取率的影响从图4可以看出随提取时间的延长，提取率增加，但在1 h后提取率增加缓慢，延长提取时间会增加生产成本，故提取时间可以控制在1 h内。
       3.1.5 提取次数对提取效果的影响固定碱水pH为11，提取温度为80℃，提取1h，料液比为1∶16，改变提取时间。不同提取次数对总异黄酮提取效果见图5。从图5可以浸提3次的效果最好，但浸提3次的效果与浸提2次则提取率增加效果不明显，提取次数增加会延长生产周期，增加成本。因此，以浸提2次为宜。
       3.2 总异黄酮提取优化工艺从上面的单因素实验可以看出总异黄酮的提取率与碱水的pH、提取温度、料液比和提取时间等因素均有关。为了对总异黄酮提取工艺条件进行优化，选择了L9(34)正交实验，其因素水平见表1。正交实验结果和极差分析见表2。图5 提取次数对总异黄酮提取率的影响表1 总异黄酮提取实验因素水平表　表2 正交实验结果与极差分析
       3.3 大孔树脂静态吸附脱附试验非极性吸附树脂D101最适于从极性溶剂中吸附非极性溶质;极性树脂D102适用于从非极性溶液中吸附极性溶质;中极性吸附树脂D103和D104，可用于从极性溶剂中吸附非极性溶质，也可用于从非极性溶剂中吸附一定极性溶质。红车轴草中总异黄酮种类多，根据黄酮母体结构上取代基羟基和糖的数量不同而极性有差异。选择了4种从非极性到极性的树脂进行试验。在相同的实验条件下，测定各树脂的静态吸附-脱附性能结果(见表3)。由表3可以看出以D103的饱和吸附量和脱附率较佳。表3 4种树脂静态饱和吸附-脱附性能测定结果
       4 结论
       通过直观的单因素实验确定最佳的单因素条件，结合正交优化实验确定最佳提取参数。
       通过碱水提取，利于后续大孔树脂吸附，降低工艺成本。
       通过以上研究得出最佳工艺参数：提取温度为80℃，提取时间为1 h，料液比为1∶12，碱水pH为11，提取2次;所得到的提取液用大孔树脂D103来进行进一步的除去水溶性杂质，精制总异黄酮。
       【参考文献】
         　[1] 新乡医学院.中药大辞典 [M]. 上海: 上海科技出版社，1975：1012.
       
       [2] 曾虹燕，周朴华.红车轴草有效成分的研究进展[J].中草药，2001，32(2): 189.
       
       [3] Peter H M. Van de Weijer, Ronald Barentsen. Isoflavones from red clover significantly reduce menopausal hot flush symptoms compared with piacebo[J]. Maturitas， 2002，42: 187.